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碧川

新虫 (小有名气)

[求助] 测乙酰胆碱酯酶抑制活性 已有1人参与

用国产96孔板测的,为什么阴性对照组的OD值比空白组还要小啊。难不成是误差?会不会太大了。

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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)迅速作用,生成在412 nm处有光吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段其 OD 值即可代表起始反应速率。


方法:

    2.65 mLPBS(pH 8.0),50μL 乙酰胆碱酯酶(0.85 U/mL) , 100 μL 15 mM DTNB 和样品溶液100μL加入试管,37 ℃预热 2 min,然后加入100 μL15 mM 硫代乙酰胆碱(起始浓度是0.5 mM),在 37 ℃ 保温 20 min 后立即加入1 mL 0.4%SDS 终止反应,将所得溶液立即在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率:

抑制率(%)=[A对照-(A 样品-A 样品空白)]/A对照×100。

    按照公式计算抑制率,以横坐标为酶促反应体系中抑制剂的浓度,纵坐标为抑制率,绘制曲线,计算其抑制率为50%时的抑制剂浓度,即为IC50。
及时行乐,人生不留遗憾!
2楼2017-07-17 23:59:51
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小卢同学

新虫 (初入文坛)

请问你用96孔板是怎么做的?能不能讲一下你的详细方法
3楼2017-08-06 10:43:32
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碧川

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小卢同学 at 2017-08-06 10:43:32
请问你用96孔板是怎么做的?能不能讲一下你的详细方法

我是根据文献做的,140μL0.1M PB+20μL待测样品DMSO溶液+20μL0.09u/ml酶溶液 混合 25℃孵化15min 再加10μL14mM ATCl 与10μL 14mM DTNB 10min后 410nm测OD值 毒扁豆碱作为阳性对照

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4楼2017-08-09 09:53:05
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碧川

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 09:53:05
我是根据文献做的,140μL0.1M PB+20μL待测样品DMSO溶液+20μL0.09u/ml酶溶液 混合 25℃孵化15min 再加10μL14mM ATCl 与10μL 14mM DTNB 10min后 410nm测OD值 毒扁豆碱作为阳性对照
...

阳性对照组我都没有做出活性 不知道问题出在哪

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5楼2017-08-09 09:53:54
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小卢同学

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 09:53:54
阳性对照组我都没有做出活性 不知道问题出在哪
...

可能是你的阳性对照物浓度低了

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6楼2017-08-09 17:12:41
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碧川

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小卢同学 at 2017-08-09 17:12:41
可能是你的阳性对照物浓度低了
...

浓度低吗。我看文献里,毒扁豆碱的IC50不到20μM,我浓度比这高也做不出来。

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7楼2017-08-09 17:36:24
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小卢同学

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 17:36:24
浓度低吗。我看文献里,毒扁豆碱的IC50不到20μM,我浓度比这高也做不出来。
...

会不会是酶浓度高了,降低酶活试一下!看有没有活性!你看到的阳性对照物的ic50是终浓度吗?如果是终浓度,那么你配的阳性对照物就按倍数换算回去!

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8楼2017-08-09 17:52:22
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碧川

新虫 (小有名气)

我明天再做一块板,再跟你讨论讨论。

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9楼2017-08-09 21:06:08
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窗外的天空26

铁虫 (著名写手)

你们做不做可逆不可逆抑制啊

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微笑生活
10楼2017-08-09 23:45:50
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