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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 测乙酰胆碱酯酶抑制活性
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碧川

新虫 (小有名气)

[求助] 测乙酰胆碱酯酶抑制活性 已有1人参与

用国产96孔板测的，为什么阴性对照组的OD值比空白组还要小啊。难不成是误差？会不会太大了。

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1楼 2017-07-17 23:33:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412 nm处有光吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段其 OD 值即可代表起始反应速率。


方法：

    2.65 mLPBS(pH 8.0),50μL 乙酰胆碱酯酶(0.85 U/mL) , 100 μL 15 mM DTNB 和样品溶液100μL加入试管，37 ℃预热 2 min，然后加入100 μL15 mM 硫代乙酰胆碱（起始浓度是0.5 mM），在 37 ℃ 保温 20 min 后立即加入1 mL 0.4％SDS 终止反应，将所得溶液立即在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率：

抑制率(％)=[A对照-(A 样品-A 样品空白)]/A对照×100。

    按照公式计算抑制率，以横坐标为酶促反应体系中抑制剂的浓度，纵坐标为抑制率，绘制曲线，计算其抑制率为50%时的抑制剂浓度，即为IC50。
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及时行乐，人生不留遗憾！
2楼2017-07-17 23:59:51
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小卢同学

新虫 (初入文坛)
请问你用96孔板是怎么做的？能不能讲一下你的详细方法
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3楼2017-08-06 10:43:32
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普通回帖

碧川

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小卢同学 at 2017-08-06 10:43:32
请问你用96孔板是怎么做的？能不能讲一下你的详细方法

我是根据文献做的，140μL0.1M PB＋20μL待测样品DMSO溶液＋20μL0.09u/ml酶溶液 混合 25℃孵化15min 再加10μL14mM ATCl 与10μL 14mM DTNB 10min后 410nm测OD值 毒扁豆碱作为阳性对照

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4楼2017-08-09 09:53:05
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碧川

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 09:53:05
我是根据文献做的，140μL0.1M PB＋20μL待测样品DMSO溶液＋20μL0.09u/ml酶溶液 混合 25℃孵化15min 再加10μL14mM ATCl 与10μL 14mM DTNB 10min后 410nm测OD值 毒扁豆碱作为阳性对照
...

阳性对照组我都没有做出活性 不知道问题出在哪

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5楼2017-08-09 09:53:54
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小卢同学

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 09:53:54
阳性对照组我都没有做出活性 不知道问题出在哪
...

可能是你的阳性对照物浓度低了

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6楼2017-08-09 17:12:41
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碧川

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小卢同学 at 2017-08-09 17:12:41
可能是你的阳性对照物浓度低了
...

浓度低吗。我看文献里，毒扁豆碱的IC50不到20μM，我浓度比这高也做不出来。

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7楼2017-08-09 17:36:24
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小卢同学

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 碧川 at 2017-08-09 17:36:24
浓度低吗。我看文献里，毒扁豆碱的IC50不到20μM，我浓度比这高也做不出来。
...

会不会是酶浓度高了，降低酶活试一下！看有没有活性！你看到的阳性对照物的ic50是终浓度吗？如果是终浓度，那么你配的阳性对照物就按倍数换算回去！

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8楼2017-08-09 17:52:22
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碧川

新虫 (小有名气)
我明天再做一块板，再跟你讨论讨论。

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9楼2017-08-09 21:06:08
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窗外的天空26

铁虫 (著名写手)
你们做不做可逆不可逆抑制啊

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微笑生活
10楼2017-08-09 23:45:50
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