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PCR、琼脂糖凝胶电泳
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电泳PCR技术核酸技术 PCR总也扩不出条带，到底是引物问题还是模板问题？求高手指点 最近做细菌DNA的PCR，条带总也不出来，有时候连二聚体都没有，单独用引物跑电泳，结果引物没有跑出条带，（如图一），用的是1.5的胶，中间是（100bpmarker），后来又重新用2.0的胶又做了一次，还是没有条带。还做了同一个模板温度梯度的PCR（从56到68度），Tm值分别为54.9，63.6（图二），目的片段大小左边是198bp，右边是158bp。感觉左边像是二聚体，右边也不对，左边第五条带感觉像是目的片段。PCR条件是94度预变性3分，94度变性30秒，56到68退火30秒，72度延伸一分钟。因为感觉左边第五条像一条目的片段。然后再次重新换模板验证第五条带的温度时是否为目的片段，2号和8号是可疑温度，两管是不同的模板，结果出来的图如图三，左边的条带不见了。加的体系及退火温度一致，却没有条带，泳道12号是另外一种菌目标片段大小158bp，但是目的条带很暗，左边也有些很暗的条带，不知道是什么。回来用提取的总DNA去跑电泳，结果如图四，各位大师们，有遇到同样的情况吗？求高手指点迷津，在此先谢谢大家了     发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2017-07-16 15:27:33
3楼2017-07-16 23:30:34
送红花一朵 |
我的引物是公司给配好的10uM的，这个引物公司还可以，身边有人用的。今天又试着减少引物量，增加模板量，同时减少循环次数，退火温度也降低了一些，然后的条带如下图。左后一排应该就是我的目的条带。但是左边的那四个是一种细菌，但是还是二聚体。明天再优化  发自小木虫IOS客户端 |
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4楼2017-07-17 21:06:04
5楼2017-07-19 00:38:45
6楼2017-07-19 18:36:36
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