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zujinshan

新虫 (初入文坛)

[求助] yjhG基因电转大肠杆菌W3100转不进 已有1人参与

我在pET20b-tac上克隆入yjhG这个基因转入W3100,转完涂板,板上什么都不长,应该不是操作问题,一起做别的就长了,哪位大神能帮帮我,怎么解决,谢谢啦
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
(1)转化方法:       
1. 在冰上解冻电  感受态细胞  添加1-10μl DNA        ,冰上培育约5分钟       
2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟       
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中       
4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT       
5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏)(检查时间常数,应该在3以上)       
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中       
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原       
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养       

(2)做感受态最重要的是菌的状态,你可以划线后再重新挑单克隆试试,转接后低温18°摇至0D600约0.4,那样做出来的感受态肯定没问题的。

(3)个人认为你可以修改几个条件
1.适当增加点质粒的量,但不要超过总体的十分之一就好;
2.DH5a感受态热击90s试试;
3.复苏培养的时候培养基改成SOC会好很多;
4.这时候的菌很脆弱,最好把转速降低点,之前有过同学只是放在恒温培养箱里静置就可以的;
5.离心时间可以增长点,比如5min;
6.涂板的时候只要涂布均匀即可,不需要太长时间;
7.涂布之后,最好正面朝上静置几分钟,新平板就时间长点,旧平板就时间短点。
个人意见,仅供参考!
及时行乐,人生不留遗憾!
2楼2017-07-11 08:29:58
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zujinshan

新虫 (初入文坛)

我同时转别的质粒就能长,感觉过程应该没问题,而且我感觉转质粒应该很好转的感觉
3楼2017-07-11 14:50:54
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