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yjhG基因电转大肠杆菌W3100转不进 已有1人参与
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| 我在pET20b-tac上克隆入yjhG这个基因转入W3100，转完涂板，板上什么都不长，应该不是操作问题，一起做别的就长了，哪位大神能帮帮我，怎么解决，谢谢啦 |
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3楼2017-07-11 14:50:54
晋鹏
版主 (知名作家)
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【答案】应助回帖
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（1）转化方法： 1. 在冰上解冻电 感受态细胞 添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 （2）做感受态最重要的是菌的状态，你可以划线后再重新挑单克隆试试，转接后低温18°摇至0D600约0.4，那样做出来的感受态肯定没问题的。 （3）个人认为你可以修改几个条件 1.适当增加点质粒的量，但不要超过总体的十分之一就好； 2.DH5a感受态热击90s试试； 3.复苏培养的时候培养基改成SOC会好很多； 4.这时候的菌很脆弱，最好把转速降低点，之前有过同学只是放在恒温培养箱里静置就可以的； 5.离心时间可以增长点，比如5min； 6.涂板的时候只要涂布均匀即可，不需要太长时间； 7.涂布之后，最好正面朝上静置几分钟，新平板就时间长点，旧平板就时间短点。 个人意见，仅供参考！ |
2楼2017-07-11 08:29:58