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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 为何小样诱导有条带，大量诱导后目的条带几乎没了？
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我是一只老年

新虫 (初入文坛)

[求助] 为何小样诱导有条带，大量诱导后目的条带几乎没了？ 已有1人参与

如图1是预诱导时的图，使用的载体是PET-32a，目的蛋白大小约66.2kDa。小样预诱导时，由于实验室内的小型超声波破碎仪坏了，跑的胶是全菌（未破碎），条带显示有我的目的条带，小样诱导的条件是：先摇菌2.5h-3h后，加IPTG 16° 诱导20h。

然后再大量摇菌，每瓶300ml，IPTG浓度取0.3M，摇菌4h后，加IPTG 16°诱导20h后用大型低温高压破碎仪破碎，破碎后发现有白色的乳状物体？？（如图2）然后离心取上清液过镍柱，用不同浓度咪唑洗脱。

可是跑胶发现我的目的蛋白浓度很低，甚至不如杂蛋白浓度。尤其是第一个孔那里的上清液中的目的蛋白浓度很低，（如图3）求助大神，为何小样诱导时条带很亮，而大量诱导反而浓度低了？是我大量诱导的条件需要改变还是蛋白在沉淀中表达？如果在沉淀中表达的话，如何才能纯化出来呢？谢谢！！

为何小样诱导有条带，大量诱导后目的条带几乎没了？
1.蛋白小样预诱导（没破碎，跑的全菌）


为何小样诱导有条带，大量诱导后目的条带几乎没了？-1
2.蛋白大量破碎后有白色乳状沉淀


为何小样诱导有条带，大量诱导后目的条带几乎没了？-2
3.大量诱导后过柱图，上清液中目的蛋白量少
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1楼 2017-06-16 09:33:37
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xhw2033696

银虫 (初入文坛)
跑一下沉淀吗，可能大部分都是包涵体的

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2楼2017-06-16 10:14:15
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我是一只老年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xhw2033696 at 2017-06-16 10:14:15
跑一下沉淀吗，可能大部分都是包涵体的

沉淀如何跑？用什么溶解
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3楼2017-06-16 10:31:14
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xhw2033696

银虫 (初入文坛)
直接加上样缓冲液跑就可以呀

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4楼2017-06-16 10:35:40
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我是一只老年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xhw2033696 at 2017-06-16 10:35:40
直接加上样缓冲液跑就可以呀

取多少沉淀啊？不应该让他溶解悬浮吗
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5楼2017-06-16 17:21:35
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飞天鱼丸

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

取少量沉淀后加20倍重量的8M尿素溶解，再跑胶。
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6楼2017-06-20 09:16:11
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