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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助HRM筛查中的困惑
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xiaomckeyan

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助HRM筛查中的困惑

求助各位大神：小的现在刚学着做HRM筛查突变。结果曲线上可明显看出有分型。可是测序结果却都是一样的。已经复查了，用的样品引物都没问题，实在想不通为啥。

求助HRM筛查中的困惑
IMG_20170609_193216.jpg
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1楼 2017-06-14 21:56:01
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bbass533

禁虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-16 08:06:04
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2楼2017-06-15 10:45:54
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xiaomckeyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-15 10:45:54
你是怎么测序的？HRM灵敏度很高的，看曲线是明显有差异，测序结果一致，说不过去。

测序结果比对过确实是欲研究序列。我用的测序引物和HRM引物不同，前者产物更长。现在怀疑HRM引物有问题，可是引物引用自权威的文献，并且我也BLAST过：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1497541511&job_key=nJZD3Xe9ehVdL-oq50rOGJ1R3yqwQsQ3sQ，确实可用。实在想不明白，难道厂家合成错了？！
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3楼2017-06-16 01:11:53
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bbass533

禁虫 (小有名气)
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4楼2017-06-16 11:43:52
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xiaomckeyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-16 11:43:52
你直接将HRM后的产物送去测序的吗？送前是否点样看过条带，单一吗？...

不是，我是用另外的引物扩增后送测序。因为该引物产物更长。测序前条带非常好。

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5楼2017-06-16 15:50:02
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bbass533

禁虫 (小有名气)
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6楼2017-06-16 17:02:37
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xiaomckeyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-16 17:02:37
那这个引物你是否进行HRM分析？是突变的吗？
有可能你送测序用的引物是非特异性引物，所以测出来的结果是一样的。建议你用筛选出突变的引物进行PCR，然后产物点样看看是否单一，再送去测序。...

谢谢你的建议。测序用的引物条带单一清晰，且结果blast后确包含有待测片段，该片段并无如此多的突变频率，所以考虑测序引物没有问题，问题可能在HRM引物上。现在正在摸条件用HRM的引物跑普通pcr，看看到底p的是什么片段。。

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7楼2017-06-16 18:52:18
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bbass533

禁虫 (小有名气)
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8楼2017-06-17 13:06:18
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xiaomckeyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-17 13:06:18
祝好运~...

谢谢！
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9楼2017-06-17 22:27:05
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