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求助HRM筛查中的困惑
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xiaomckeyan
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求助HRM筛查中的困惑
求助各位大神:小的现在刚学着做HRM筛查突变。结果曲线上可明显看出有分型。可是测序结果却都是一样的。已经复查了,用的样品引物都没问题,实在想不通为啥。
IMG_20170609_193216.jpg
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bbass533
at 2017-06-15 10:45:54
你是怎么测序的?HRM灵敏度很高的,看曲线是明显有差异,测序结果一致,说不过去。
测序结果比对过确实是欲研究序列。我用的测序引物和HRM引物不同,前者产物更长。现在怀疑HRM引物有问题,可是引物引用自权威的文献,并且我也BLAST过:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1497541511&job_key=nJZD3Xe9ehVdL-oq50rOGJ1R3yqwQsQ3sQ,确实可用。实在想不明白,难道厂家合成错了?!
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bbass533
at 2017-06-16 11:43:52
你直接将HRM后的产物送去测序的吗?送前是否点样看过条带,单一吗?...
不是,我是用另外的引物扩增后送测序。因为该引物产物更长。测序前条带非常好。
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2017-06-16 15:50:02
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bbass533
at 2017-06-16 17:02:37
那这个引物你是否进行HRM分析?是突变的吗?
有可能你送测序用的引物是非特异性引物,所以测出来的结果是一样的。建议你用筛选出突变的引物进行PCR,然后产物点样看看是否单一,再送去测序。...
谢谢你的建议。测序用的引物条带单一清晰,且结果blast后确包含有待测片段,该片段并无如此多的突变频率,所以考虑测序引物没有问题,问题可能在HRM引物上。现在正在摸条件用HRM的引物跑普通pcr,看看到底p的是什么片段。。
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2017-06-16 18:52:18
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bbass533
at 2017-06-17 13:06:18
祝好运~...
谢谢!
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2017-06-17 22:27:05
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