| 查看: 2157 | 回复: 4 | |||
Catherine92金虫 (小有名气)
|
[交流]
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案 已有4人参与
|
|
PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。 但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下： 问题一：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无  原因： 1、模板:含有抑制物，含量低 2、Buffer对样品不合适 3、引物设计不当或者发生降解 4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策： 1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2、更换Buffer或调整浓度 3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4、降低退火温度、延长延伸时间 问题二：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带  原因： 1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶量过多 4、Mg2+浓度偏高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多 对策： 1、重新设计引物或者使用巢式PCR 2、适当降低模板或引物浓度 3、适当减少酶量 4、降低镁离子浓度 5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6、减少循环次数 问题三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态  原因： 1、模板不纯 2、Buffer不合适 3、退火温度偏低 4、酶量过多 5、dNTP、Mg 2+浓度偏高 6、循环次数过多 对策： 1、纯化模板 2、更换Buffer 3、适当提高退火温度 4、适量用酶 5、适当降低dNTP和镁离子的浓度 6、减少循环次数 问题四：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 |
回复此楼» 猜你喜欢
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
-
透明质酸酶的作用机制：如何实现药物递送
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有209人回复
-
爱思维尔旗下LWT投稿
已经有9人回复
-
替拉扎明为缺氧选择性细胞毒药物研究提供新思路
已经有0人回复
-
拉坦前列腺素(Latanoprost)：前列腺素F2α衍生物如何成为青光眼一线用药
已经有0人回复
-
卟啉家族中的明星分子：MESO-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉的性质与制备
已经有1人回复
-
宠物寄生虫防治：氟雷拉纳阻断GABA受体，持效12周驱杀跳蚤蜱虫
已经有0人回复
-
为呼吸打开通道：依伐卡托的科学之旅
已经有1人回复
-
Dordaviprone（ONC201）：小分子药物在中线胶质瘤中的应用
已经有0人回复
-
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
|
顶一下 发自小木虫Android客户端 |
2楼2017-07-04 18:28:25
3楼2017-07-16 15:41:06
4楼2017-11-12 16:08:32
principle616
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 33.5
- 帖子: 5
- 在线: 2.3小时
- 虫号: 6912550
- 注册: 2017-07-06
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2017-11-17 09:02:18
精华III:
20