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Catherine92金虫 (小有名气)
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[交流]
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案 已有4人参与
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PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。 但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下： 问题一：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无  原因： 1、模板:含有抑制物，含量低 2、Buffer对样品不合适 3、引物设计不当或者发生降解 4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策： 1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2、更换Buffer或调整浓度 3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4、降低退火温度、延长延伸时间 问题二：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带  原因： 1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶量过多 4、Mg2+浓度偏高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多 对策： 1、重新设计引物或者使用巢式PCR 2、适当降低模板或引物浓度 3、适当减少酶量 4、降低镁离子浓度 5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6、减少循环次数 问题三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态  原因： 1、模板不纯 2、Buffer不合适 3、退火温度偏低 4、酶量过多 5、dNTP、Mg 2+浓度偏高 6、循环次数过多 对策： 1、纯化模板 2、更换Buffer 3、适当提高退火温度 4、适量用酶 5、适当降低dNTP和镁离子的浓度 6、减少循环次数 问题四：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 |
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