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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot新抗体无条带
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)

[交流] western blot新抗体无条带

Western blot，新买的novusbio公司的抗体（鼠抗），小鼠肝脏组织蛋白上样48ug，还是看不见目的条带，此基因的mRNA水平在后面几个样品是显著下降的，但是此抗体连清晰的条带都看不到，预测大小在58KD左右，是这个抗体不好，还是我做的有问题？封闭是5%BSA室温一小时；一抗是按说明书1:500用BSA5%配的，孵育过夜4度；二抗是5%BSA配的鼠抗1:2000室温一小时。

western blot新抗体无条带
图片1.jpg
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1楼 2017-05-20 17:40:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

F翔T

银虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-20 22:24:23
虽然总蛋白量挺多，但是可能是你的目的蛋白比较少。组织蛋白一般背景都比较深，所以抗体浓度就很重要了，如果太高就很容易背景深，多洗一洗也可以减少背景。
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w雨过天晴j
2楼2017-05-20 17:59:59
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
全换成奶粉配   含tween

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3楼2017-05-21 06:59:15
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普通回帖

小小虫小虫

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们当时是用的5％的牛奶封闭的

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4楼2017-05-21 13:17:28
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小小虫小虫

新虫 (初入文坛)
洗的时候用的TBST

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5楼2017-05-21 13:17:57
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肖末子言

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by F翔T at 2017-05-20 17:59:59
虽然总蛋白量挺多，但是可能是你的目的蛋白比较少。组织蛋白一般背景都比较深，所以抗体浓度就很重要了，如果太高就很容易背景深，多洗一洗也可以减少背景。

多洗会不会把目的蛋白洗掉啊

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6楼2017-05-21 13:48:26
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by F翔T at 2017-05-20 17:59:59
虽然总蛋白量挺多，但是可能是你的目的蛋白比较少。组织蛋白一般背景都比较深，所以抗体浓度就很重要了，如果太高就很容易背景深，多洗一洗也可以减少背景。

这是扫的第一张，我看没有条带，就调了对比度，所以背景就深了，但是为什么marker都这么清楚？
western blot新抗体无条带-1



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7楼2017-05-21 18:10:47
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w雨过天晴j

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by F翔T at 2017-05-20 17:59:59
虽然总蛋白量挺多，但是可能是你的目的蛋白比较少。组织蛋白一般背景都比较深，所以抗体浓度就很重要了，如果太高就很容易背景深，多洗一洗也可以减少背景。

Marker70的位置还有第一个和第二个样本的位置为什么有那么一大坨黑的

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8楼2017-05-21 18:11:47
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gengxin60
9楼2017-05-21 18:20:44
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F翔T

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 肖末子言 at 2017-05-21 13:48:26
多洗会不会把目的蛋白洗掉啊
...

当然洗不掉啦

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10楼2017-05-21 18:33:42
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