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壳聚糖季铵盐对戊型肝炎病毒多肽疫苗免疫效果影响的研究
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随着科技不断的发展与进步，科研人员研制出的各种有效的疫苗，对各种传染病的预防和控制已经达到了显著效果。免疫佐剂作为疫苗的添加剂，对疫苗的免疫预防作用有效地发挥起着至关重要的作用。免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，以及能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型的物质。佐剂对疫苗免疫效应的增强作用主要表现在:能在机体内缓慢释放抗原物质以延长疫苗与免疫细胞的作用时间;能通过增加抗原物质的表面积使之易于被巨噬细胞识别和吞噬;刺激淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体;提高机体抗体滴度;能够改变抗体的类型以及增强迟发型变态反应。传统的免疫佐剂种类繁多，按免疫原性可分为具备免疫原性的佐剂和不具备免疫原性的佐剂，按化学性质可分为无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂四种。随着新型疫苗的不断发展，对免疫佐剂的各方面的要求也提高了，传统的免疫佐剂因其安全性、免疫刺激效果等问题逐渐受到质疑和淘汰，新的免疫佐剂的研究越来越受到广泛关注。 壳聚糖(chitosan，CS)是由自然界中的甲壳素经脱乙酰作用得到的，是天然多糖中带正电的高分子物质，具有化学稳定性良好、无毒无害、生物相容性优良和代谢产物无毒并能被生物体完全吸收等优点。但CS在水中的溶解度非常低，广泛应用受到了一定限制。水溶性壳聚糖衍生物的制备解决了CS溶解性问题，具有更广泛的研究和应用前景。本实验室按照文献以3-氯-2-羟丙基-三甲基氯化铵（3-chloro-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride，CTA）为化学改性剂对CS进行接枝改性制备的壳聚糖季铵盐——3-氯-2-羟丙基三甲基壳聚糖（3-chlorine-2-hydroxypropyl trimethyl chitosan，HTCC）接枝度高达71.4％，溶解性高达70.1mg/ml。本实验以HTCC作为免疫佐剂，表达的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)重组蛋白作为多肽疫苗，免疫接种小鼠，检测免疫指标以评价HTCC作为免疫佐剂的潜质。 本研究主要内容包括以下几方面: 1.HEV重组蛋白的表达、纯化、复性和鉴定 将包含HEV ORF2基因片段（394aa-660aa）和HEV ORF3全基因的表达质粒pET28a-ORF23在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,37℃，200rpm条件下诱导培养4h后，分别取培养液、超声上清和沉淀样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果显示HEV重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。超声沉淀经低浓度尿素溶液洗涤、高浓度尿素溶解、Ni-NTAHis·Bind(@) Resins纯化、梯度浓度的尿素复性液透析复性、聚乙二醇浓缩获得纯化的重组蛋白。分别取蛋白粗纯化样品、Ni-NTA His·Bind(@) Resins纯化样品以及复性浓缩后的样品进行SDS-PAGE分析得出:低浓度尿素洗涤效果良好，去除了包涵体中大量的杂蛋白;Ni-NTA His·Bind(@) Resins纯化效果显著，得到了高纯度的目的蛋白;纯化蛋白复性和浓缩后蛋白条带清晰度高、条带单一表明获得了一定纯度和浓度的HEV重组蛋白。复性浓缩的蛋白经Western blot分析表明其免疫原性良好。复性浓缩后的HEV重组蛋白作为多肽疫苗免疫小鼠。 2.免疫效果的研究 50只Balb/c雌性小鼠随机分为5组:①加HTCC佐剂组(1.5mg/ml HTCC+0.2mg/ml HEV重组蛋白);②阳性组（弗氏佐剂+0.2mg/ml HEV重组蛋白）;③不加佐剂组（0.2mg/ml HEV重组蛋白）;④HTCC(1.5mg/ml)组;⑤PBS组。各组小鼠后腿肌肉注射200μl/只·次，间隔3周加强免疫一次，共免疫2次。在初次免疫2周、加强免疫2周和5周三个免疫阶段，5组小鼠尾部静脉取血分离血清，采用ELISA检测抗HEV-IgG抗体水平。末次免疫5周后，四色流式细胞术检测免疫小鼠全血中CD4+、CD8+、IFN-γ+和IL-4+细胞的百分率;MTS法检测小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖反应。 加HTCC佐剂组在三个免疫阶段中血清中的抗HEV-IgG抗体均极显著高于不加佐剂组(P＜0.01)，其小鼠脾脏T淋巴细胞的蛋白刺激指数也显著高于不加佐剂组（P＜0.05）。流式细胞术结果表明各组间的CD4+细胞百分率无显著差异，加HTCC佐剂组的IFN-γ+细胞百分率显著高于不加佐剂组和两个阴性组(P＜0.05)，其IL-4+细胞百分率显著低于不加佐剂组和两个阴性组（P＜0.05）。 综上所述，，HTCC作为HEV重组多肽疫苗的佐剂接种免疫小鼠，在一定程度上增强了多肽疫苗的免疫效果。  原文地址：ontores |
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