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[交流]
关于质粒载体，引物设计，及重组连接
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我因为要扩增出一段目的基因并转入PNZ8112载体 现在关于PCR扩增目的基因的引物设计有些迷惑 本人纯属菜鸟，祈望各路大侠不吝赐教 载体图谱如下： 该载体我有些看不懂 1）repC, repA，cm ，Pnis，ssUSP,His， T分别是什么意思？ 2）内圈里面的红色箭头是什么意思？指互补链么？ 3）为什么右上方用绿色标识？是特指那段是多克隆位点吗？还有绿色中间还有一小段黑色的？在T的位置怎么还有个蓝色的框？ 我的目的片段与该载体都有以下三个酶切位点：NaeI， speI , XmnI 是说我在设计引物的时候不可以用以上这三个克隆为点么！？ 还麻烦各路英雄帮我看看我的目的基因插入在哪两个酶切为点之间比较合适！ 我的目的片段是1134bp的 是不是大于600的就不好扩或者是说扩增效率很低？ 我这个载体是专门转化乳酸乳球菌的特异性载体 现在只能用以下这两个酶切位点“kpnI”和“XbaI”了 现在有疑问 我本来对设计引物的思路还是比较清晰 结果后来是越看越糊涂 我的目的基因是UreB，菌株是幽门螺杆菌“ss1” 一个是希望大家给我提提一件 再一个是看看有没有高人给我看看我这个实验的可行性怎么样 谢谢 [ Last edited by 1yangz on 2009-1-10 at 21:39 ] |
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1） repC, repA，cm ，Pnis，ssUSP,His 这一堆里面只知道His是可以加在目的片段编码蛋白后面的6个（一般）组氨酸密码子，根据你设计的引物可以确定带或不带这个标签，可以通过这个标签来纯化外源DNA表达的蛋白。 其他的几个应该都是这个质粒的重要组成部分，可能涉及到质粒载体的复制，外源片段的表达，克隆子的筛选标记等等重要方面，具体就不清楚了。 2）红色箭头应该表示的是主链DNA的阅读方向，也就是插入外源片段的有意义链应该顺着这个方向才能表达出相应的蛋白序列。 3）不是很明白，多克隆位点就是那些酶切点密集的区域了，至于为什么是绿色的，这个没有规定吧，目的应该是区别于其他区域。 T 指的是什么我也不知道，难道是翻译的终止点？？ 也请高手指教。 目的片段与载体上都有的酶切点就不要用了，要不然你会发现你的头会变大的。准确的来讲不知道这个质粒对于600bp以上长片段是否适合，但通常的质粒对于你的1000多bp的片段应该没问题。 外源片段的插入位置应该由你自己确定，根据多克隆位点选择合适的酶，然后再注意把切点序列设计到引物上（期间注意好序列的编码框）。一个质粒上的多克隆位点可能不止图上的这几个，可以看具体序列确定。 |
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