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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于质粒载体，引物设计，及重组连接
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cjzshr

金虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论`
我最近也在做相关方面的内容，是这回答一下
（1）完全不懂
（2）红色箭头是阅读反方向，插入序列要顺着这个方向
（3）为多克隆位点，设计引物时尽量找距离较远酶切位点，且最好有共用BUFFER,并且避开你的序列上已有的酶切位点，要不然双酶切鉴定时，就把你的片段切碎了。
1000bp的片段表达效率应该不会有什么问题。
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11楼2009-01-11 17:45:59
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q,感谢参与讨论~~
尿素酶啊，呵呵，试试吧。把KpnI的识别序列放在上游引物的5'端，加好保护碱基，确认编码框正确。XbaI的识别序列加在下游引物的5'端，同样保护好。PCR出来后纯化或抽提一下然后能双切就双切，不能的话就单切，抽提/纯化，然后再用另一个酶单切，然后连接转化，ok了。然后酶切、测序鉴定一下筛选出来的克隆子，至于以后表达什么的就要看你是不是继续做了。以前用大肠杆菌表达过尿素酶，不过没有活性，呵呵。
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金币是赌出来的
12楼2009-01-12 08:57:28
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