应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于质粒载体，引物设计，及重组连接
121/2返回列表12下一页
查看: 1581  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

1yangz

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于质粒载体，引物设计，及重组连接

我因为要扩增出一段目的基因并转入PNZ8112载体
现在关于PCR扩增目的基因的引物设计有些迷惑
本人纯属菜鸟，祈望各路大侠不吝赐教

载体图谱如下：


该载体我有些看不懂
1）repC, repA，cm ，Pnis，ssUSP,His， T分别是什么意思？
2）内圈里面的红色箭头是什么意思？指互补链么？
3）为什么右上方用绿色标识？是特指那段是多克隆位点吗？还有绿色中间还有一小段黑色的？在T的位置怎么还有个蓝色的框？

我的目的片段与该载体都有以下三个酶切位点：NaeI， speI , XmnI
是说我在设计引物的时候不可以用以上这三个克隆为点么！？
还麻烦各路英雄帮我看看我的目的基因插入在哪两个酶切为点之间比较合适！
我的目的片段是1134bp的
是不是大于600的就不好扩或者是说扩增效率很低？


我这个载体是专门转化乳酸乳球菌的特异性载体
现在只能用以下这两个酶切位点“kpnI”和“XbaI”了
现在有疑问
我本来对设计引物的思路还是比较清晰
结果后来是越看越糊涂

我的目的基因是UreB，菌株是幽门螺杆菌“ss1”
一个是希望大家给我提提一件
再一个是看看有没有高人给我看看我这个实验的可行性怎么样
谢谢

[ Last edited by 1yangz on 2009-1-10 at 21:39 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-01-07 23:45:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
内圈里面的红色箭头 表示方向
我的目的片段与该载体都有以下三个酶切位点：NaeI， speI , XmnI
是说我在设计引物的时候不可以用以上这三个克隆为点么  是的不可以用 否则片段也切开了
要看你用什么公司的酶 只要选择公用buffer的就可以双酶切了
赞一下(10人) 回复此楼
2楼2009-01-08 10:38:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1yangz

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by snzydong at 2009-1-8 10:38:
内圈里面的红色箭头 表示方向
我的目的片段与该载体都有以下三个酶切位点：NaeI， speI , XmnI
是说我在设计引物的时候不可以用以上这三个克隆为点么  是的不可以用 否则片段也切开了
要看你用什么公司的酶 只 ...

谢谢！
回复此楼
3楼2009-01-08 11:16:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

study236

银虫 (小有名气)
你可以用简单载体即不带有酶切位点的载体，然后设计引物时，添加上酶切位点和保护碱基
赞一下 回复此楼
4楼2009-01-08 13:42:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1yangz

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by study236 at 2009-1-8 13:42:
你可以用简单载体即不带有酶切位点的载体，然后设计引物时，添加上酶切位点和保护碱基

我上面的载体专门用来转化乳酸乳球菌的
我必须的用这个载体
谢谢你的回答!
赞一下 回复此楼
5楼2009-01-08 14:10:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1yangz

新虫 (初入文坛)
晕
是没有高手呢还是问题太简单不屑回答啊
赞一下 回复此楼
6楼2009-01-08 22:10:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论`
1）  repC, repA，cm ，Pnis，ssUSP,His  这一堆里面只知道His是可以加在目的片段编码蛋白后面的6个（一般）组氨酸密码子，根据你设计的引物可以确定带或不带这个标签，可以通过这个标签来纯化外源DNA表达的蛋白。  其他的几个应该都是这个质粒的重要组成部分，可能涉及到质粒载体的复制，外源片段的表达，克隆子的筛选标记等等重要方面，具体就不清楚了。
2）红色箭头应该表示的是主链DNA的阅读方向，也就是插入外源片段的有意义链应该顺着这个方向才能表达出相应的蛋白序列。
3）不是很明白，多克隆位点就是那些酶切点密集的区域了，至于为什么是绿色的，这个没有规定吧，目的应该是区别于其他区域。 T 指的是什么我也不知道，难道是翻译的终止点？？ 也请高手指教。
      目的片段与载体上都有的酶切点就不要用了，要不然你会发现你的头会变大的。准确的来讲不知道这个质粒对于600bp以上长片段是否适合，但通常的质粒对于你的1000多bp的片段应该没问题。
      外源片段的插入位置应该由你自己确定，根据多克隆位点选择合适的酶，然后再注意把切点序列设计到引物上（期间注意好序列的编码框）。一个质粒上的多克隆位点可能不止图上的这几个，可以看具体序列确定。
赞一下(11人) 回复此楼
金币是赌出来的
7楼2009-01-09 10:49:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1yangz

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2009-1-9 10:49:
1）  repC, repA，cm ，Pnis，ssUSP,His  这一堆里面只知道His是可以加在目的片段编码蛋白后面的6个（一般）组氨酸密码子，根据你设计的引物可以确定带或不带这个标签，可以通过这个标签来纯化外源DNA表达的蛋白。 ...

谢谢你

我这个载体是专门转化乳酸乳球菌的特异性载体
现在只能用以下这两个酶切位点“kpnI”和“XbaI”了
现在有疑问
我本来对设计引物的思路还是比较清晰
结果后来是越看越糊涂
我的序列是UreB，菌株是幽门螺杆菌“ss1”
一个是希望大家给我提提一件
再一个是看看有没有高人给我看看我这个实验的可行性怎么样
谢谢
赞一下 回复此楼
8楼2009-01-10 21:37:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fulixia

银虫 (小有名气)
有载体和目的基因序列的话，可以用Vector NTI进行分析，如果没有只能手工操作，比较麻烦。如果有序列，不会用软件的话，可以和我联系（QQ:767288335）
赞一下 回复此楼
9楼2009-01-10 22:43:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bone0611

★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论`
T大概是指这里有一个多聚T的粘性切开末端，你的目的片段可以TA克隆上去。
rep应该是指复制子
赞一下(10人) 回复此楼
10楼2009-01-10 23:07:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 1yangz 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭