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Erlineee

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因扩增PCR一直跑不出亮带 已有2人参与

表示刚刚学习这些东西真是万事开头难…跑了好几天真的想哭……
想请教一下:
1.   做反转录的时候RNA是不是不能震荡?
2.  基因片段684dp,引物的GC含量和TM一般多少比较合适还是没有什么影响?
3.  Taq酶影响大不大?
4.  pcr仪的值你们一般怎么设定的呀……
5.  跑出来连maker都不太亮到底是怎么了

一直在找原因,第一天没跑出来第二天重新设了温度梯度,第三天重新做了模板……表示毫无起色求指导~谢大神们

基因扩增PCR一直跑不出亮带


@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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18794008527

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR扩增体系操作需要注意枪头中的各种试剂是否都加进去了,随时换枪头;另外引物是自己设计的吗?一般退火温度都是50℃-60℃之间,你可以试试A200PCR扩增仪,以12个孔进行温度梯度试试;整个操作过程都应该在冰上操作,尤其是Taq酶易失活,应该一直放在冰上。
8楼2017-05-09 20:23:13
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)

rt后的模版要稀释才可以做pcr TM一般是引物温度减3-5度 maker不亮说明你胶做的可能有问题或者电泳的tae buffer需要换了

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2楼2017-05-09 06:07:23
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wbhnan

新虫 (初入文坛)

首先maker不亮是胶的问题,然后扩增选用引物是否是特意引物,把你的条件发一下看看

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3楼2017-05-09 07:23:29
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Erlineee

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2017-05-09 06:07:23
rt后的模版要稀释才可以做pcr TM一般是引物温度减3-5度 maker不亮说明你胶做的可能有问题或者电泳的tae buffer需要换了

rt稀释过了的,温度我是最低温减3度到最高温加3度(不超过60度)设置了四个梯度,胶我用的稀释的tae50倍液(里面还加了RNA酶清除剂),然后1:100的胶粉,DNA buffer也没过期呀,一般一个胶孔是打多少buffer和样呀

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4楼2017-05-09 10:46:58
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