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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切之后线性载体转化后仍然长斑，怎么样才能不长斑
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 酶切之后线性载体转化后仍然长斑，怎么样才能不长斑 已有2人参与

虫友好：
       我的质粒酶切后，直接取2微升电泳检测，检测发现只有线性载体单一的条带，然后取1微升转化大肠杆菌，结果发现长了大约100多个斑。

      限制性内切酶是用的 ThermoFisher Scientific公司的FastDigest 的KpnⅠ和BamHI 双酶切，酶切时间15分钟、30分钟、2小时、3小时均酶切过。电泳检测

仅有线性化条带，载体大小8K，转化大肠杆菌也长斑。

     酶切体系 50微升
     质粒（1000ng/μl）              2μl
     Kpn1                                    3
     BamHI                                  3
     10Xbuffer                             5
     ddH2O                            to 50μl

同时酶切纯化电泳检测后，又再次进行酶切，转化大肠杆菌后，仍然长斑。

请问各位虫友，这个问题要怎么解决呢？或者大家有没有遇到类似的情况，又是怎么解决的，谢谢大家！


    @biostar2009@youlinglyw
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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
1楼 2017-05-08 00:49:09
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hijack_208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
drwhoknowss: 金币+1, 有理有据 2018-01-31 11:39:59
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如不酶切，50ul取1ul电泳也包含2*10^9个拷贝。按照trans1-t1的转化效率10^9cfu/ug计算，要长10^7个斑，现在只长100个斑，说明酶切非常充分了。
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2楼2018-01-30 22:21:17
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by hijack_208 at 2018-01-30 22:21:17
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如 ...

补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-31 11:41:04
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hijack_208 at 2018-01-30 22:21:17
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如 ...

谢谢

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
4楼2018-01-31 23:17:11
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-31 11:41:04
补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。...

谢谢

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
5楼2018-01-31 23:17:19
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云浅月

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-31 11:41:04
补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。...

您好，我有个问题，载体本身有氨苄抗性，我想在这个载体上连接一个卡那抗性基因，双酶切连接后转化在卡那板上长出来菌了，但是这个菌在氨苄不长了。这是为什么呀？望您有时间帮我解答一下，非常感谢！
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6楼2019-10-21 10:44:53
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