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MAS_rice至尊木虫 (著名写手)
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酶切之后线性载体转化后仍然长斑，怎么样才能不长斑已有2人参与
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虫友好： 我的质粒酶切后，直接取2微升电泳检测，检测发现只有线性载体单一的条带，然后取1微升转化大肠杆菌，结果发现长了大约100多个斑。 限制性内切酶是用的 ThermoFisher Scientific公司的FastDigest 的KpnⅠ和BamHI 双酶切，酶切时间15分钟、30分钟、2小时、3小时均酶切过。电泳检测 仅有线性化条带，载体大小8K，转化大肠杆菌也长斑。 酶切体系 50微升 质粒（1000ng/μl） 2μl Kpn1 3 BamHI 3 10Xbuffer 5 ddH2O to 50μl 同时酶切纯化电泳检测后，又再次进行酶切，转化大肠杆菌后，仍然长斑。 请问各位虫友，这个问题要怎么解决呢？或者大家有没有遇到类似的情况，又是怎么解决的，谢谢大家！  @biostar2009@youlinglyw |
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【答案】应助回帖
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drwhoknowss: 金币+1, 有理有据 2018-01-31 11:39:59
drwhoknowss: 金币+1, 有理有据 2018-01-31 11:39:59
| 8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如不酶切，50ul取1ul电泳也包含2*10^9个拷贝。按照trans1-t1的转化效率10^9cfu/ug计算，要长10^7个斑，现在只长100个斑，说明酶切非常充分了。 |
2楼2018-01-30 22:21:17
3楼2018-01-31 11:41:04
MAS_rice
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4楼2018-01-31 23:17:11
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