应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切之后线性载体转化后仍然长斑，怎么样才能不长斑
61/1返回列表
查看: 2180  |  回复: 5
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者MAS_rice将赠送您 100 个金币

MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 酶切之后线性载体转化后仍然长斑，怎么样才能不长斑已有2人参与

虫友好：
       我的质粒酶切后，直接取2微升电泳检测，检测发现只有线性载体单一的条带，然后取1微升转化大肠杆菌，结果发现长了大约100多个斑。

      限制性内切酶是用的 ThermoFisher Scientific公司的FastDigest 的KpnⅠ和BamHI 双酶切，酶切时间15分钟、30分钟、2小时、3小时均酶切过。电泳检测

仅有线性化条带，载体大小8K，转化大肠杆菌也长斑。

     酶切体系 50微升
     质粒（1000ng/μl）              2μl
     Kpn1                                    3
     BamHI                                  3
     10Xbuffer                             5
     ddH2O                            to 50μl

同时酶切纯化电泳检测后，又再次进行酶切，转化大肠杆菌后，仍然长斑。

请问各位虫友，这个问题要怎么解决呢？或者大家有没有遇到类似的情况，又是怎么解决的，谢谢大家！


    @biostar2009@youlinglyw
回复此楼

» 猜你喜欢
竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
1楼2017-05-08 00:49:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hijack_208

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
drwhoknowss: 金币+1, 有理有据 2018-01-31 11:39:59
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如不酶切，50ul取1ul电泳也包含2*10^9个拷贝。按照trans1-t1的转化效率10^9cfu/ug计算，要长10^7个斑，现在只长100个斑，说明酶切非常充分了。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2018-01-30 22:21:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by hijack_208 at 2018-01-30 22:21:17
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如 ...

补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。
赞一下 回复此楼
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-31 11:41:04
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hijack_208 at 2018-01-30 22:21:17
8k的片段，如果是2ug的质粒有1.1*10^11个克隆（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/rna-tools-and-calculators/dna-and-rna-molecular-weights-and-conversions.html）。假如 ...

谢谢

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
4楼2018-01-31 23:17:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-31 11:41:04
补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。...

谢谢

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
5楼2018-01-31 23:17:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

云浅月

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-31 11:41:04
补充一点，大肠杆菌自身有连接酶。只要你的抗性基因在，总会长的。...

您好，我有个问题，载体本身有氨苄抗性，我想在这个载体上连接一个卡那抗性基因，双酶切连接后转化在卡那板上长出来菌了，但是这个菌在氨苄不长了。这是为什么呀？望您有时间帮我解答一下，非常感谢！
赞一下 回复此楼
6楼2019-10-21 10:44:53
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 MAS_rice 的主题更新
61/1返回列表
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫 SCI英文润色翻译-EnPapers美团队-先修改后付款
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 34岁读博士晚吗 +30 emitdne 2024-06-13 30/1500 2024-06-17 17:08 by 白米粒向日葵
[基金申请] 我标书代码变了 +43 学员NHuqdk 2024-06-16 57/2850 2024-06-17 16:53 by superdb
[有机交流] 车间生产，真空度很高，温度很高，但减压蒸馏速度很慢。 10+12 召唤鬼泣lL 2024-06-13 38/1900 2024-06-17 16:46 by 科研虫子小助手
[催化] 镍负载氧化铝的保存问题 8+3 lwn0130 2024-06-15 4/200 2024-06-17 10:48 by adaihao
[硕博家园] 博士毕业高校和就业的相关问题 +6 SCITOPPP 2024-06-14 10/500 2024-06-17 10:08 by SCITOPPP
[博后之家] 山东大学(青岛)“天然药物生物智造”课题组 招聘“博士后”(年薪20.4-55.6万元) +5 第二种态度 2024-06-11 11/550 2024-06-17 10:08 by 小懂事k
[找工作] 成都产品质量检测研究院 200+3 鲸鱼663 2024-06-11 10/500 2024-06-17 08:31 by yudaoqian88
[基金申请] 关于博后基金的bug问题 +6 lxr1991 2024-06-14 9/450 2024-06-15 21:17 by since—2010
[基金申请] BO4的YQ答辩通知发布了吗？ +6 博学笃行 2024-06-11 6/300 2024-06-15 16:04 by 悲催科研狗
[论文投稿] 投稿时忘记修改一作 +7 gll123456 2024-06-13 11/550 2024-06-15 11:49 by gll123456
[论文投稿] 求机械类四区sci推荐 5+3 迷茫小旷 2024-06-14 4/200 2024-06-15 11:25 by bobvan
[论文投稿] 投了一篇4区的SCI，审稿人一个拒稿，一个小修，编辑给了大修。 +9 安稳22123 2024-06-13 10/500 2024-06-14 23:45 by jurkat.1640
[基金申请] 面上基金有一个（两个）C是不是就没戏了.... 5+3 zzzm116 2024-06-13 17/850 2024-06-14 22:26 by lzt8076
[硕博家园] 关于硕博连读的一些疑问？ +4 Lwenter 2024-06-14 4/200 2024-06-14 14:32 by ou0551
[基金申请] 国自然基金公布的时候基金号有吗 +8 潇洒怡惜 2024-06-13 11/550 2024-06-14 11:24 by JRfei
[论文投稿] 投稿后发现其他作者的邮箱填错了该怎么办呀 10+4 在飞的猪 2024-06-13 6/300 2024-06-14 04:45 by 小虫子咔咔
[硕博家园] 科研求助 +5 杲www 2024-06-12 6/300 2024-06-13 16:16 by 姓李名明
[考博] 博导选择 +3 bing85977 2024-06-12 3/150 2024-06-13 15:34 by 我是邱尧
[硕博家园] 考博应该从哪里开始准备 +6 亮姐2019 2024-06-11 8/400 2024-06-13 12:53 by 帕秋莉GO
[硕博家园] 申博 +3 悦悦小小鱼 2024-06-12 3/150 2024-06-12 15:11 by chen5805
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭