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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用NcoI位点设计引物
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by charon1982 at 2009-1-6 17:24:
第二个氨基酸的突变，要看你的第二个氨基酸是否于蛋白的结构形成关系大不大！

这样啊，呵呵，谢谢！
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11楼2009-01-07 00:16:21
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):3Q,感谢参与讨论~~
1。“不是我想加，是我必须用NcoI这个位点插入，所以必然引入了ＡＴＧ”，对于这个问题，不用人为加入ATG的，因为每个基因的ORF都是以ATG或GTG开始的，而ATG的启始效率是最高的。。。
2。“为什么不一定在这个位置启动表达啊？” ，。。。我们分析基因中的序列就可以知道，也许基因序列当中也有多个ATG这样的序列，为什么不从中间的ATG（AUG）开始表达呢，那是因为，它附近没有RBS（核糖体结合位点），没有办法完成多肽的组装了。。。所以启始翻译的AUG前面4-8个碱基之前必定有RBS（核糖体结合位点）。。。
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12楼2009-01-07 03:17:14
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nnxqwei at 2009-1-7 03:17:
1。“不是我想加，是我必须用NcoI这个位点插入，所以必然引入了ＡＴＧ”，对于这个问题，不用人为加入ATG的，因为每个基因的ORF都是以ATG或GTG开始的，而ATG的启始效率是最高的。。。
2。“为什么不一定在这个位 ...

那就是说，只有在启动子后面第一个ATG是真正起到起始密码子功能的吧？RBS应该是位于启动子上的吧？
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13楼2009-01-07 09:39:28
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
“那就是说，只有在启动子后面第一个ATG是真正起到起始密码子功能的吧？RBS应该是位于启动子上的吧？”晕！

你可能搞混了启始密码子和启动子两个不同的概念了！！！！？？？

RBS在mRNA分子上 ,它对应的DNA分子上有AAGGAGG这样的序列。启动子在DNA分子上。。。应该说在mRNA上的RBS后面第一个AUG是真正起到起始密码子功能的！也就是说RBS位于启始密码子AUG的前面，间隔有几个碱基。。。RBS就是核糖体的结合位点。


而启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位,也就是使转录开始的部位，是DNA转录到mRNA关键，在基因表达的调控中,转录的起始是个关键。。。

而RBS是mRNA上核糖体的结合位点呀，一般为UAAGGAGG之类的。。。
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14楼2009-01-07 11:33:40
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nnxqwei at 2009-1-7 11:33:
“那就是说，只有在启动子后面第一个ATG是真正起到起始密码子功能的吧？RBS应该是位于启动子上的吧？”晕！

你可能搞混了启始密码子和启动子两个不同的概念了！！！！？？？

RBS在mRNA分子上 ,它对应的DNA分 ...

那一般将目的基因直接克隆在启动子后面，这之间并没有核糖体结合位点DNA序列呀？哪里去了呢？
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15楼2009-01-07 23:18:21
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
启动子后面有些序列，在转录后是核糖体结合位点，起着转录启始作用！当然为了方便说，它对应的DNA也标了RBS的，但说“RBS应该是位于启动子上的吧”是错的，只能说RBS位于起始密码子AUG的前面。。。

这几天回答了论坛里不少问题，一个金币也不得，下次不干了。。。
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16楼2009-01-09 02:53:28
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
楼上开穷疯了,,到文献求助哪了,他们不给会被罚的.


如果是表达载体,载体上有启动子和起始密码子,而且是经过优化的,一般不必改变,
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
17楼2009-01-09 23:08:18
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
“楼上开穷疯了,,到文献求助哪了,他们不给会被罚的.”--简直是乱弹，我常用我的金币为小师弟们找资料，如果付出了劳动，得不到肯定，不觉得郁闷吗？？？以后不会再回答问题了哦
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18楼2009-01-11 23:26:11
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hll8593

木虫 (小有名气)
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。

　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

　　6.碱基要随机分布。

　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

　　11.引物应具有特异性。

　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

　　1)避免重复碱基，尤其是G.

　　2)Tm=58-60度。

　　3）GC=30-80%.

　　4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

　　5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

　　6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

　　7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
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19楼2009-09-05 15:52:02
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