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安静的位置i金虫 (小有名气)
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[交流]
关于用NcoI位点设计引物
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我想设计一条引物，以NcoI为酶切位点，它的识别序列是CCATGG。 （1）这样它自身带有ATG，而ATG后面的G恰好会造成移码突变，我是不是需要在G后面再补加两个碱基，这样蛋白就变了，能不能有什么办法去掉那个G，表达天然的目的蛋白呢（除了下面的）？ （2）如果酶切后用klenow补平，是不是就会补成CCATG,这样就没有最后的那个G了？ |
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“那就是说，只有在启动子后面第一个ATG是真正起到起始密码子功能的吧？RBS应该是位于启动子上的吧？”晕！ 你可能搞混了启始密码子和启动子两个不同的概念了！！！！？？？ RBS在mRNA分子上 ,它对应的DNA分子上有AAGGAGG这样的序列。启动子在DNA分子上。。。应该说在mRNA上的RBS后面第一个AUG是真正起到起始密码子功能的！也就是说RBS位于启始密码子AUG的前面，间隔有几个碱基。。。RBS就是核糖体的结合位点。 而启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位,也就是使转录开始的部位，是DNA转录到mRNA关键，在基因表达的调控中,转录的起始是个关键。。。 而RBS是mRNA上核糖体的结合位点呀，一般为UAAGGAGG之类的。。。 |
14楼2009-01-07 11:33:40
eaglezheng
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2楼2009-01-05 23:22:13
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1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加的G是去不掉的）。如果你想表达的蛋白一个氨基酸也不变，那可以考虑用平端连接。也就是ATG........，用高保真酶（如pfu ，pyrobest等）PCR后产生平末端，不用加酶切位点，但平末端连接效果好差，而且有相反的方向。。。。 2。酶切后用klenow补平，也去不掉G的，因为读的方向是5‘-ATGG。。。。3’ |
3楼2009-01-06 02:12:14
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