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安静的位置i

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[交流] 关于用NcoI位点设计引物

我想设计一条引物，以NcoI为酶切位点，它的识别序列是CCATGG。
（1）这样它自身带有ATG，而ATG后面的G恰好会造成移码突变，我是不是需要在G后面再补加两个碱基，这样蛋白就变了，能不能有什么办法去掉那个G，表达天然的目的蛋白呢（除了下面的）？
（2）如果酶切后用klenow补平，是不是就会补成CCATG,这样就没有最后的那个G了？

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1楼2009-01-05 22:26:16

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eaglezheng

铁虫 (小有名气)

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没看明白lz的意思，一般的引物加酶切位点后再加上保护碱基对引物没什么影响

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2楼2009-01-05 23:22:13

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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

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安静的位置i(金币+5,VIP+0):谢谢！

1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加的G是去不掉的）。如果你想表达的蛋白一个氨基酸也不变，那可以考虑用平端连接。也就是ATG........，用高保真酶（如pfu ，pyrobest等）PCR后产生平末端，不用加酶切位点，但平末端连接效果好差，而且有相反的方向。。。。

2。酶切后用klenow补平，也去不掉G的，因为读的方向是5‘-ATGG。。。。3’

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3楼2009-01-06 02:12:14

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安静的位置i

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引用回帖:

Originally posted by nnxqwei at 2009-1-6 02:12:
1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加 ...

谢谢楼上的回答！你的方法很好！突变一个G比较好：）
对于我的第二个问题，我可能没有说清楚，我的质粒上有Nco1这样的位点，我必须要用这个位点插入片段，而且这个位点上目前有一个别的片段，我要先用Nco1酶切掉这个片段，然后用Klenow补平这个质粒，再用你说的高保真酶PCR目的片段，这样平段连接，应该就是ＡＴＧ＋目的基因了吧？呵呵，我觉得您给我提供的方法就是这个意思吧？

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4楼2009-01-06 09:14:33

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