应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用NcoI位点设计引物
191/2返回列表12下一页
查看: 1558  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] 关于用NcoI位点设计引物

我想设计一条引物，以NcoI为酶切位点，它的识别序列是CCATGG。
（1）这样它自身带有ATG，而ATG后面的G恰好会造成移码突变，我是不是需要在G后面再补加两个碱基，这样蛋白就变了，能不能有什么办法去掉那个G，表达天然的目的蛋白呢（除了下面的）？
（2）如果酶切后用klenow补平，是不是就会补成CCATG,这样就没有最后的那个G了？
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-01-05 22:26:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eaglezheng

铁虫 (小有名气)
没看明白lz的意思，一般的引物加酶切位点后再加上保护碱基对引物没什么影响
赞一下 回复此楼
2楼2009-01-05 23:22:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
安静的位置i(金币+5,VIP+0):谢谢！
1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加的G是去不掉的）。如果你想表达的蛋白一个氨基酸也不变，那可以考虑用平端连接。也就是ATG........，用高保真酶（如pfu ，pyrobest等）PCR后产生平末端，不用加酶切位点，但平末端连接效果好差，而且有相反的方向。。。。

2。酶切后用klenow补平，也去不掉G的，因为读的方向是5‘-ATGG。。。。3’
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2009-01-06 02:12:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nnxqwei at 2009-1-6 02:12:
1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加 ...

谢谢楼上的回答！你的方法很好！突变一个G比较好：）
对于我的第二个问题，我可能没有说清楚，我的质粒上有Nco1这样的位点，我必须要用这个位点插入片段，而且这个位点上目前有一个别的片段，我要先用Nco1酶切掉这个片段，然后用Klenow补平这个质粒，再用你说的高保真酶PCR目的片段，这样平段连接，应该就是ＡＴＧ＋目的基因了吧？呵呵，我觉得您给我提供的方法就是这个意思吧？
赞一下 回复此楼
4楼2009-01-06 09:14:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
很有意思，怎么感觉像你在人为的加上一个ATG啊，而不是你原有目的基因的原始启动子啊
赞一下 回复此楼
帮助虫友，提升自己
5楼2009-01-06 10:02:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)
我也觉得第二个氨基酸变了应该影响不大
赞一下 回复此楼
6楼2009-01-06 10:57:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by charon1982 at 2009-1-6 10:02:
很有意思，怎么感觉像你在人为的加上一个ATG啊，而不是你原有目的基因的原始启动子啊

不是我想加，是我必须用NcoI这个位点插入，所以必然引入了ＡＴＧ
赞一下 回复此楼
7楼2009-01-06 17:03:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
那你引入ATG，也不一定在这里启动表达啊
赞一下 回复此楼
帮助虫友，提升自己
8楼2009-01-06 17:21:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
第二个氨基酸的突变，要看你的第二个氨基酸是否于蛋白的结构形成关系大不大！
赞一下 回复此楼
帮助虫友，提升自己
9楼2009-01-06 17:24:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by charon1982 at 2009-1-6 17:21:
那你引入ATG，也不一定在这里启动表达啊

请教下为什么不一定在这个位置启动表达啊？
赞一下 回复此楼
10楼2009-01-07 00:15:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 安静的位置i 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +3 章小鱼567 2026-03-23 3/150 2026-03-24 20:25 by 汪！？！
[考研] 300分，材料，求调剂，英一数二 +4 超赞的 2026-03-24 4/200 2026-03-24 20:01 by 了了了了。。
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +5 谷雨上岸 2026-03-23 6/300 2026-03-24 16:32 by laoshidan
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程（085601） +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[考研] 277分求调剂，跨调材料 +3 考研调剂lxh 2026-03-24 3/150 2026-03-24 13:52 by JourneyLucky
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 085600材料与化工调剂 +7 A-哆啦Z梦 2026-03-23 12/600 2026-03-23 23:16 by 星空星月
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 9/450 2026-03-23 12:57 by yqdszhdap－
[考研] 352求调剂 +3 大米饭！ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123！
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[基金申请] 山东省面上项目限额评审 +4 石瑞0426 2026-03-19 4/200 2026-03-22 08:50 by Wei_ren
[考研] 280求调剂 +11 咕噜晓晓 2026-03-18 12/600 2026-03-21 22:40 by ACS Nano——
[考研] 297求调剂 +11 戏精丹丹丹 2026-03-17 12/600 2026-03-21 17:47 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 279求调剂 +5 红衣隐官 2026-03-21 5/250 2026-03-21 14:59 by lature00
[考研] 一志愿西南交大，求调剂 +5 材化逐梦人 2026-03-18 5/250 2026-03-21 00:26 by JourneyLucky
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭