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安静的位置i金虫 (小有名气)
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[交流]
关于用NcoI位点设计引物
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我想设计一条引物，以NcoI为酶切位点，它的识别序列是CCATGG。 （1）这样它自身带有ATG，而ATG后面的G恰好会造成移码突变，我是不是需要在G后面再补加两个碱基，这样蛋白就变了，能不能有什么办法去掉那个G，表达天然的目的蛋白呢（除了下面的）？ （2）如果酶切后用klenow补平，是不是就会补成CCATG,这样就没有最后的那个G了？ |
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nnxqwei
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1。“不是我想加，是我必须用NcoI这个位点插入，所以必然引入了ＡＴＧ”，对于这个问题，不用人为加入ATG的，因为每个基因的ORF都是以ATG或GTG开始的，而ATG的启始效率是最高的。。。 2。“为什么不一定在这个位置启动表达啊？” ，。。。我们分析基因中的序列就可以知道，也许基因序列当中也有多个ATG这样的序列，为什么不从中间的ATG（AUG）开始表达呢，那是因为，它附近没有RBS（核糖体结合位点），没有办法完成多肽的组装了。。。所以启始翻译的AUG前面4-8个碱基之前必定有RBS（核糖体结合位点）。。。 |
12楼2009-01-07 03:17:14
eaglezheng
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2楼2009-01-05 23:22:13
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1。基因通常以ATG作为启始密码子，如果NcoI为酶切位点进行连接表达，而基因第4个碱基不是G的话，可以把第4个碱基变为G，这样突变了一个氨基酸，对酶学特性影响不大，总比补加两个碱基从而多一个氨基酸较好。（补加的G是去不掉的）。如果你想表达的蛋白一个氨基酸也不变，那可以考虑用平端连接。也就是ATG........，用高保真酶（如pfu ，pyrobest等）PCR后产生平末端，不用加酶切位点，但平末端连接效果好差，而且有相反的方向。。。。 2。酶切后用klenow补平，也去不掉G的，因为读的方向是5‘-ATGG。。。。3’ |
3楼2009-01-06 02:12:14
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