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哈哈11111111

新虫 (初入文坛)

[求助] KOD酶扩增很多杂带 已有1人参与

用的是51-59的温度梯度一种DNA,marker是2k的,目的条带在1600bp,做了很多次总是有三条带,求大神指导啊

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匿名

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-04-26 07:44:22
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3楼2017-04-25 15:53:23
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匿名

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4楼2017-04-25 15:58:02
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

对。提高退火。然后,其实kod酶好像对引物的特异性不强,所以,可以换个酶试试。

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当你当你的眼睛眯着笑
5楼2017-04-26 01:00:26
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匿名

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7楼2017-04-26 12:39:10
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匿名

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哈哈11111111(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-04-26 16:36:37
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8楼2017-04-26 12:45:00
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草溪河

铁虫 (著名写手)

主要还是引物特异性吧。如果是克隆某个片段,只要有你的目的条带就行,切下回收测序条带正确就行,不一定非得是单一条带。但是如果是检测或者其他用途除外,主要是看具体目的。

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11楼2017-04-26 15:32:47
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哈哈11111111

新虫 (初入文坛)

2楼2017-04-25 10:38:58
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哈哈11111111

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by XL_Yang at 2017-04-25 15:53:23
一般这种情况原因有:退火温度低(适当提高退火温度,Tm-5),引物特异性差(检查特异性,重新设计引物),模板被污染(对模板进行电泳检测,更换模板),扩增循环数太多(克隆PCR循环数最好不要超高30),祝你实验 ...

我用的是51到59度梯度,还要提高温度么?

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6楼2017-04-26 10:44:47
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哈哈11111111

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by XL_Yang at 2017-04-26 12:39:10
看看你引物的TM 值先,如果是65以上,那你用的退火温度是不是低了!
...

引物单上是51度

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9楼2017-04-26 14:54:19
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哈哈11111111

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by XL_Yang at 2017-04-26 12:45:00
看你的电泳图没怎么跑开,但仔细看,也是有主带的。你使用梯度退火,较低温度下,非特异已经开始了,后面再逐步提升温度,非特异还是存在。不要嫌麻烦,多做几次,每次设定一个退火温度,从高往低,你会找到一个合 ...

好的,谢谢啦

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10楼2017-04-26 14:55:41
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