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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 这个问题困扰我一个月了，跪求各位知道的虫友帮忙解决，重组质粒双酶切问题
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

[求助] 这个问题困扰我一个月了，跪求各位知道的虫友帮忙解决，重组质粒双酶切问题 已有2人参与

目的基因：1600bp
目的载体1：7000bp；目的载体2：:9000bp
目的基因和和T载相连，双酶切，没问题，正常，双酶切回收后，和同样双酶切的两个载体相连，转化大肠JM109，菌液PCR正常，提质粒双酶切，出现若干条带，有目的基因，有载体，但是出现很多奇怪的条带，而且几个平行的样都是一致的，载体单独酶切过，没有问题，目的基因之前和其他载体连接 ，没问题。
用的酶切位点是：BamH I,Mlu I
                            BamH I,EcoR I
一句话总结就是，重组质粒双酶切多条带
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1楼 2017-04-21 10:28:53
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
困扰个啥，直接测序了。BamH I单酶切也是这个样。
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2楼2017-04-21 11:34:52
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你太善良

新虫 (著名写手)
没图没真相

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3楼2017-04-21 12:13:52
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-21 11:34:52
困扰个啥，直接测序了。BamH I单酶切也是这个样。

对，我重组质粒单酶切就出现了三四个条带，所以可能是BamH I的原因么？我之前送测，是和T载相连的菌液送去的，但是序列比对发现是T载上的序列，但我双酶切得到了目的基因的
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4楼2017-04-21 14:03:50
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 你太善良 at 2017-04-21 12:13:52
没图没真相

图在此，10000marker
这个问题困扰我一个月了，跪求各位知道的虫友帮忙解决，重组质粒双酶切问题


这个问题困扰我一个月了，跪求各位知道的虫友帮忙解决，重组质粒双酶切问题-1


这个问题困扰我一个月了，跪求各位知道的虫友帮忙解决，重组质粒双酶切问题-2



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5楼2017-04-21 14:08:25
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)
求大家都帮我看看，实验一直卡在 这里

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6楼2017-04-21 14:39:50
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶不行了
使用质粒pcr，载体引物+目的基因引物
若能pcr出来，送质粒测序
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7楼2017-04-23 01:06:21
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
初步推测要么是酶切位点的选择有问题，要么是酶不行了，另外不建议连T载体，pcr验证假阳性较高不可信；建议酶切后直接连载体，验证时只用酶切验证即可

发自小木虫Android客户端
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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
8楼2017-04-23 10:22:38
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