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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

[求助] 这个问题困扰我一个月了,跪求各位知道的虫友帮忙解决,重组质粒双酶切问题 已有2人参与

目的基因:1600bp
目的载体1:7000bp;目的载体2::9000bp
目的基因和和T载相连,双酶切,没问题,正常,双酶切回收后,和同样双酶切的两个载体相连,转化大肠JM109,菌液PCR正常,提质粒双酶切,出现若干条带,有目的基因,有载体,但是出现很多奇怪的条带,而且几个平行的样都是一致的,载体单独酶切过,没有问题,目的基因之前和其他载体连接 ,没问题。
用的酶切位点是:BamH I,Mlu I
                            BamH I,EcoR I
一句话总结就是,重组质粒双酶切多条带
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
困扰个啥,直接测序了。BamH I单酶切也是这个样。
2楼2017-04-21 11:34:52
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你太善良

新虫 (著名写手)

3楼2017-04-21 12:13:52
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-21 11:34:52
困扰个啥,直接测序了。BamH I单酶切也是这个样。

对,我重组质粒单酶切就出现了三四个条带,所以可能是BamH I的原因么?我之前送测,是和T载相连的菌液送去的,但是序列比对发现是T载上的序列,但我双酶切得到了目的基因的
4楼2017-04-21 14:03:50
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 你太善良 at 2017-04-21 12:13:52
没图没真相

图在此,10000marker
这个问题困扰我一个月了,跪求各位知道的虫友帮忙解决,重组质粒双酶切问题


这个问题困扰我一个月了,跪求各位知道的虫友帮忙解决,重组质粒双酶切问题-1


这个问题困扰我一个月了,跪求各位知道的虫友帮忙解决,重组质粒双酶切问题-2



发自小木虫IOS客户端
5楼2017-04-21 14:08:25
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爱萌的小天使

铁虫 (初入文坛)

求大家都帮我看看,实验一直卡在 这里

发自小木虫IOS客户端
6楼2017-04-21 14:39:50
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶不行了
使用质粒pcr,载体引物+目的基因引物
若能pcr出来,送质粒测序
7楼2017-04-23 01:06:21
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976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长

初步推测要么是酶切位点的选择有问题,要么是酶不行了,另外不建议连T载体,pcr验证假阳性较高不可信;建议酶切后直接连载体,验证时只用酶切验证即可

发自小木虫Android客户端
耻与众草之为伍,何亭亭而独芳!何不为人之所赏兮,深山穷谷委严霜。
8楼2017-04-23 10:22:38
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