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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助连接转化问题（如何提高白斑数目啊）
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)

[交流] 求助连接转化问题（如何提高白斑数目啊）

小弟在构建宏基因组文库，连接体系是10或者20ul。
其中10ul体系用来化转，20ul体系电转。
10ul体系包括：
1ul 去磷酸化质粒（PBS SK+　2958bp）
3、5、7ul　DNA（2－9KB）
0.5ul　T4　DNA　ligase
1ul　buffer
16度过夜和16度过夜后再4度过夜都试过。

感受态细胞为DH5a,自己作的（TSS），并且用puc19检测过其转化效率，都高于10的八次幂。

化转时10ul全部用来化转，电转时乙醇沉淀洗盐纯化后溶于15ul，取5ul用于电转。
但是转化后全部涂布仅仅只有100个白斑，效率太低了啊
要是建个20000个克隆的库，那转化就转死人了。下面的电泳图为质粒载体和DNA的量的比较。　VECTOR 2ul　VS　DNA　5　ul


大家帮忙分析下怎样提高白斑数目啊，小弟不胜感激啊。
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1楼 2009-01-02 15:47:23
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MAIZE

★ ★ ★
微笑漩涡(金币+3,VIP+0):谢谢您宝贵的建议啊
用于转化的连接产物根本就没有必要重新纯化，纯化过程中会有很大的损失。你的载体片断已经非常浓了，连接时用10ul体系，1ul载体，1ul酶，1ulbuffer，其余全部加你的片断，片段越多越好。取5ul用于转化，效率应该很好。我最近2个月成功连接了10个载体，小有一些心得。
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2楼2009-01-02 15:55:04
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by MAIZE at 2009-1-2 15:55:
用于转化的连接产物根本就没有必要重新纯化，纯化过程中会有很大的损失。你的载体片断已经非常浓了，连接时用10ul体系，1ul载体，1ul酶，1ulbuffer，其余全部加你的片断，片段越多越好。取5ul用于转化，效率应该很 ...

我用化转行么？我是指电转的时候我才纯化的。

另外您说的5ul是用来化转还是电转啊？

[ Last edited by 微笑漩涡 on 2009-1-2 at 16:21 ]
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3楼2009-01-02 16:02:47
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
★ ★
微笑漩涡(金币+2,VIP+0):谢谢
我做建库的时候也是刚开始的时候电转化效率很低，我的长的还没有你的多。我当时是200的感受态取一微升能长几个菌落，后来调整了方法，每一微升都能长好几百个。你可以参照一下。
保证你的感受态是电转感受态，我也是自己做的，没问题
电转的时候可以不用在超净台中做，直接在外面加样，减少冻融时间，保证脉冲时间
菌复苏的时候，确定转速，太快太慢都不行，快了，菌受不住，慢，单克隆太少
然后涂板，你可以不用涂菌棒，直接稀释后晃匀即可。而且不能用LB稀释，我觉得你极有可能是这步有问题。LB直接稀释电转菌，容易杀死菌。
个人一点经验，你可以参照一下
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4楼2009-01-02 16:58:11
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
★
微笑漩涡(金币+1,VIP+0):谢谢
建库的时候不能有化转，效率太低了。最好的方法就是电转。
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5楼2009-01-02 16:59:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
微笑漩涡(金币+2,VIP+0):谢谢　啊
建库的话，电转好些
要化转的话，首先，用好一点的连接酶，比如NEB的，那个效果非常好
要不然就用Fermantas的
连接物跑电泳都看得清，证明是非常浓的了
fmol级别都能化转出来，更别说是这种了
我觉得是连接这一步不好
用好点的酶绝对 出来
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6楼2009-01-02 18:14:50
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-1-2 18:14:
建库的话，电转好些
要化转的话，首先，用好一点的连接酶，比如NEB的，那个效果非常好
要不然就用Fermantas的
连接物跑电泳都看得清，证明是非常浓的了
fmol级别都能化转出来，更别说是这种了
我觉得是连接这 ...

我用的NEB的啊，还有就是电转化前那个连接产物纯化是必须的么？另外我的载体较小，目的片段较大，连接的时候是不是时间要比较长啊。还有就是像我这样连接转化后涂布100ul是不是太多了对于这样浓度的DNA

[ Last edited by 微笑漩涡 on 2009-1-2 at 21:22 ]
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7楼2009-01-02 20:59:05
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2009-1-2 16:58:
我做建库的时候也是刚开始的时候电转化效率很低，我的长的还没有你的多。我当时是200的感受态取一微升能长几个菌落，后来调整了方法，每一微升都能长好几百个。你可以参照一下。
保证你的感受态是电转感受态，我 ...

能否提供下参考参数啊　
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8楼2009-01-02 21:12:23
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
顶起，大家还有什么好的建议给小弟提呀，不胜感激
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9楼2009-01-03 10:46:57
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kousyouki

铁虫 (小有名气)
想听听化转的~~
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10楼2009-01-17 05:45:36
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