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微笑漩涡新虫 (著名写手)
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求助连接转化问题（如何提高白斑数目啊）
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小弟在构建宏基因组文库，连接体系是10或者20ul。 其中10ul体系用来化转，20ul体系电转。 10ul体系包括： 1ul 去磷酸化质粒（PBS SK+ 2958bp） 3、5、7ul DNA（2－9KB） 0.5ul T4 DNA ligase 1ul buffer 16度过夜和16度过夜后再4度过夜都试过。 感受态细胞为DH5a,自己作的（TSS），并且用puc19检测过其转化效率，都高于10的八次幂。 化转时10ul全部用来化转，电转时乙醇沉淀洗盐纯化后溶于15ul，取5ul用于电转。 但是转化后全部涂布仅仅只有100个白斑，效率太低了啊  要是建个20000个克隆的库，那转化就转死人了。下面的电泳图为质粒载体和DNA的量的比较。 VECTOR 2ul VS DNA 5 ul 大家帮忙分析下怎样提高白斑数目啊，小弟不胜感激啊。 |
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8楼2009-01-02 21:12:23
2楼2009-01-02 15:55:04
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微笑漩涡(金币+2,VIP+0):谢谢
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我做建库的时候也是刚开始的时候电转化效率很低，我的长的还没有你的多。我当时是200的感受态取一微升能长几个菌落，后来调整了方法，每一微升都能长好几百个。你可以参照一下。 保证你的感受态是电转感受态，我也是自己做的，没问题 电转的时候可以不用在超净台中做，直接在外面加样，减少冻融时间，保证脉冲时间 菌复苏的时候，确定转速，太快太慢都不行，快了，菌受不住，慢，单克隆太少 然后涂板，你可以不用涂菌棒，直接稀释后晃匀即可。而且不能用LB稀释，我觉得你极有可能是这步有问题。LB直接稀释电转菌，容易杀死菌。 个人一点经验，你可以参照一下 |
4楼2009-01-02 16:58:11