| 查看: 792 | 回复: 9 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
微笑漩涡新虫 (著名写手)
|
[交流]
求助连接转化问题（如何提高白斑数目啊）
|
||
|
小弟在构建宏基因组文库，连接体系是10或者20ul。 其中10ul体系用来化转，20ul体系电转。 10ul体系包括： 1ul 去磷酸化质粒（PBS SK+ 2958bp） 3、5、7ul DNA（2－9KB） 0.5ul T4 DNA ligase 1ul buffer 16度过夜和16度过夜后再4度过夜都试过。 感受态细胞为DH5a,自己作的（TSS），并且用puc19检测过其转化效率，都高于10的八次幂。 化转时10ul全部用来化转，电转时乙醇沉淀洗盐纯化后溶于15ul，取5ul用于电转。 但是转化后全部涂布仅仅只有100个白斑，效率太低了啊  要是建个20000个克隆的库，那转化就转死人了。下面的电泳图为质粒载体和DNA的量的比较。 VECTOR 2ul VS DNA 5 ul 大家帮忙分析下怎样提高白斑数目啊，小弟不胜感激啊。 |
回复此楼» 猜你喜欢
274求调剂
已经有20人回复
-
265求调剂
已经有16人回复
-
材料与化工304求B区调剂
已经有6人回复
-
321求调剂
已经有5人回复
-
085600材料与化工306
已经有7人回复
-
085602化学工程求调剂。
已经有4人回复
-
312求调剂
已经有10人回复
-
材料考研求调剂
已经有6人回复
-
调剂推荐
已经有5人回复
-
中国科学院深圳先进技术研究院-光纤传感课题组招生-中国科学院大学、深圳理工大学联培
已经有4人回复
微笑漩涡
新虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.6
- 散金: 232
- 帖子: 1003
- 在线: 87.3小时
- 虫号: 577221
- 注册: 2008-06-22
- 专业: 生物大分子结构与功能
9楼2009-01-03 10:46:57
2楼2009-01-02 15:55:04
微笑漩涡
新虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.6
- 散金: 232
- 帖子: 1003
- 在线: 87.3小时
- 虫号: 577221
- 注册: 2008-06-22
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2009-01-02 16:02:47
yuhuimeiye
木虫 (著名写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 1968.6
- 散金: 4250
- 红花: 7
- 帖子: 1179
- 在线: 178小时
- 虫号: 650152
- 注册: 2008-11-09
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★
微笑漩涡(金币+2,VIP+0):谢谢
微笑漩涡(金币+2,VIP+0):谢谢
|
我做建库的时候也是刚开始的时候电转化效率很低，我的长的还没有你的多。我当时是200的感受态取一微升能长几个菌落，后来调整了方法，每一微升都能长好几百个。你可以参照一下。 保证你的感受态是电转感受态，我也是自己做的，没问题 电转的时候可以不用在超净台中做，直接在外面加样，减少冻融时间，保证脉冲时间 菌复苏的时候，确定转速，太快太慢都不行，快了，菌受不住，慢，单克隆太少 然后涂板，你可以不用涂菌棒，直接稀释后晃匀即可。而且不能用LB稀释，我觉得你极有可能是这步有问题。LB直接稀释电转菌，容易杀死菌。 个人一点经验，你可以参照一下 |
4楼2009-01-02 16:58:11
20