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小菜搞研究

新虫 (初入文坛)

[求助] BiFc载体构建 已有1人参与

小新最近在做BiFc载体的构建,将目的片段设计成含有XbaI和KpnI的片段后,将SpYCEM-150和SpYNE-150各自用双酶切(时间试过30分和45分、1h)后,同源重组,(载体和片段的比例试过2:5,4:3),然后正常的转化大肠杆菌(也换过感受态细胞),现在有三个N段的载体构好了,N段还有两个,但最重要的C段的载体怎么弄都没弄出来,没弄出来的这几个转化时挑单克隆几乎没有、郁闷了,希望各位前辈多多帮忙一下,谢谢谢谢

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小菜搞研究

新虫 (初入文坛)

载体大概10K以上,片段是500-1000,质粒双酶切后用的是切胶回收(师姐强烈嘱咐的),我也不知道为什么,今年研一所以特别懵逼

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2楼2017-04-02 05:22:36
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用的什么牌子的同源重组酶,你的酶是不是效率不行。
与人玫瑰手有余香
3楼2017-04-02 21:36:04
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小菜搞研究

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-02 21:36:04
用的什么牌子的同源重组酶,你的酶是不是效率不行。

之前三个N端的载体都是用酶CE ||同源重组的,好像是takara还是trans的

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4楼2017-04-03 00:20:20
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虫虫辈

新虫 (初入文坛)

5楼2018-08-27 09:39:39
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zhouzhou7614

新虫 (初入文坛)

想问一下,最后做出来了吗?我现在也在构建这个载体,两端的都连不上,求助
6楼2018-10-14 22:26:09
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