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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 用过NdeⅠ和XhoⅠ的帮帮忙啊
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可以吗

银虫 (小有名气)

[交流] 用过NdeⅠ和XhoⅠ的帮帮忙啊

我打算用NdeⅠ和XhoⅠ这两个酶做双酶切，但是据说这两个酶酶切效率和连接效率都很低，请问
1.   这两个酶能同时做双切吗？还是要单独切？
2.   酶切时的酶和载体的量是多少？温度、时间呢？
3.   这两个酶切后vector和外源基因的比例是多少？时间？温度？


总之，有用过的就进来讲讲经验吧，希望能使试验进行顺利一些，谢谢啦
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1楼 2008-12-29 22:03:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
Double Digest Recommendation(s) for NdeI + XhoI:
Digest in NEBuffer 4 + BSA at 37°C.


NEB的建议
NEB的酶很少有所谓的效率低的问题
根据酶活定义，1个单位的酶1小时消化1ug DNA
具体的酶切条件看说明书
Vector和insert的比例你是说连接的时候吗？
一般是1：3~1：10，我喜欢1：5（摩尔比）
连接也用好一点的酶，没有所谓的连不上的
不要用takara的任何工具酶，要买就买NEB的
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2楼2008-12-29 23:01:13
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andyhu2001

银虫 (小有名气)
可以查一查takara的产品手册，上面有反应温度等条件，特别注意两个酶的反应温度是否一致
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但行好事，莫问前程！
3楼2008-12-29 23:09:26
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
要注意保护碱基
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4楼2008-12-30 08:18:33
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kinase

铁虫 (著名写手)
我们实验室最常用的内切酶就是这两个，我们基本上80%的克隆都是用的是这两个酶，而且我们是混着用的，用的是NEB的NdeI，TAKARA的XhoI，buffer一般用TAKARA的bufferH，加BSA（BSA用NEB的还是TAKARA的都没有关系，注意他们两家公司的储液浓度是不一样的），50ul的体系里，各加1ul，37度3小时，完全没有问题啊。
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5楼2008-12-30 19:51:02
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可以吗

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by kinase at 2008-12-30 19:51:
我们实验室最常用的内切酶就是这两个，我们基本上80%的克隆都是用的是这两个酶，而且我们是混着用的，用的是NEB的NdeI，TAKARA的XhoI，buffer一般用TAKARA的bufferH，加BSA（BSA用NEB的还是TAKARA的都没有关系，注 ...

谢谢了啊，这个解答比较好。当然所有的解答对我都是有帮助的，非常感谢。
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6楼2008-12-31 13:11:46
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可以吗

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by kinase at 2008-12-30 19:51:
我们实验室最常用的内切酶就是这两个，我们基本上80%的克隆都是用的是这两个酶，而且我们是混着用的，用的是NEB的NdeI，TAKARA的XhoI，buffer一般用TAKARA的bufferH，加BSA（BSA用NEB的还是TAKARA的都没有关系，注 ...

请问你们用了什么保护碱基？
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7楼2008-12-31 13:39:09
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jasco

木虫 (正式写手)
这两个酶我也常用的，双切，保护碱基用4个ok，多点更好啦
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8楼2008-12-31 14:23:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
用NEB的酶1个小时绰绰有余……混用酶效果不好……
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9楼2008-12-31 15:02:22
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
Nde I不太好切，保护碱基在7个的酶切效率是75％，如果还是酶切不成功TA克隆到载体上再酶切，这样效果比较好。
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10楼2008-12-31 15:25:37
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