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可以吗

银虫 (小有名气)

[交流] 用过NdeⅠ和XhoⅠ的帮帮忙啊

我打算用NdeⅠ和XhoⅠ这两个酶做双酶切,但是据说这两个酶酶切效率和连接效率都很低,请问
1.   这两个酶能同时做双切吗?还是要单独切?
2.   酶切时的酶和载体的量是多少?温度、时间呢?
3.   这两个酶切后vector和外源基因的比例是多少?时间?温度?


总之,有用过的就进来讲讲经验吧,希望能使试验进行顺利一些,谢谢啦
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

用NEB的酶1个小时绰绰有余……混用酶效果不好……
9楼2008-12-31 15:02:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

Double Digest Recommendation(s) for NdeI + XhoI:
Digest in NEBuffer 4 + BSA at 37°C.


NEB的建议
NEB的酶很少有所谓的效率低的问题
根据酶活定义,1个单位的酶1小时消化1ug DNA
具体的酶切条件看说明书
Vector和insert的比例你是说连接的时候吗?
一般是1:3~1:10,我喜欢1:5(摩尔比)
连接也用好一点的酶,没有所谓的连不上的
不要用takara的任何工具酶,要买就买NEB的
2楼2008-12-29 23:01:13
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andyhu2001

银虫 (小有名气)

可以查一查takara的产品手册,上面有反应温度等条件,特别注意两个酶的反应温度是否一致
但行好事,莫问前程!
3楼2008-12-29 23:09:26
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kinase

铁虫 (著名写手)

我们实验室最常用的内切酶就是这两个,我们基本上80%的克隆都是用的是这两个酶,而且我们是混着用的,用的是NEB的NdeI,TAKARA的XhoI,buffer一般用TAKARA的bufferH,加BSA(BSA用NEB的还是TAKARA的都没有关系,注意他们两家公司的储液浓度是不一样的),50ul的体系里,各加1ul,37度3小时,完全没有问题啊。
5楼2008-12-30 19:51:02
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