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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR求助
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叮龙猫

新虫 (初入文坛)

[求助] 巢式PCR求助 已有3人参与

巢式PCR第一次扩了3轮，第一轮隐约看到单一条带，模板不稀释跑第二轮为smear带，第三轮以第二轮的模板稀释10倍没有条带，哪位大神能解释一下吗？后来换了引物做第二次，此次扩两轮，第一轮和第二轮都看不到条带？各位大神能否解疑？

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1楼 2017-03-24 22:05:25
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
巢式PCR产物要稀释，否则上一轮残余的引物会影响下一轮的引物退火延伸，上一轮的模板量不要超过下一轮PCR体系的2%
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2楼2017-03-24 23:19:59
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 叮龙猫 at 2017-03-24 23:42:48
我第二次扩的第二轮有做稀释20倍，也有不稀释的但都没有条带，每次模板都是1ul，PCR体系为25ul，我试试减少模板量。请问大神巢式PCR还有别的注意事项吗？
...

主要是上一轮的残余引物会对后面的影响比较大，所以要稀释。模板量2%的意思是：如果你做第二轮PCR，体系是25ul，那么加入的第一轮的模板量不要超过0.5ul
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6楼2017-03-25 00:32:03
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lusandanooo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做巢式是会把第一轮PCR产物纯化了，然后稀释50倍作为模板，加1ul，进行第二轮PCR
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毕了业真开心嘻嘻嘻嘻嘻
8楼2017-03-27 15:24:43
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普通回帖

叮龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-03-24 23:19:59
巢式PCR产物要稀释，否则上一轮残余的引物会影响下一轮的引物退火延伸，上一轮的模板量不要超过下一轮PCR体系的2%

我第二次扩的第二轮有做稀释20倍，也有不稀释的但都没有条带，每次模板都是1ul，PCR体系为25ul，我试试减少模板量。请问大神巢式PCR还有别的注意事项吗？

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3楼2017-03-24 23:42:48
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叮龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-03-24 23:19:59
巢式PCR产物要稀释，否则上一轮残余的引物会影响下一轮的引物退火延伸，上一轮的模板量不要超过下一轮PCR体系的2%

还有你说的模板量不超过体系的2%是指每一轮的模板量吗？还是从第二轮开始？

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4楼2017-03-24 23:54:24
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叮龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 叮龙猫 at 2017-03-24 23:54:24
还有你说的模板量不超过体系的2%是指每一轮的模板量吗？还是从第二轮开始？
...

没仔细看不好意思呀

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5楼2017-03-25 00:01:29
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叮龙猫

新虫 (初入文坛)
希望有其他大神继续解答

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7楼2017-03-25 16:58:35
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布za

铜虫 (初入文坛)
模板稀释500倍试试

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9楼2017-03-27 19:25:07
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匿名

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10楼2017-03-28 12:58:56
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