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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我在做融合pcr，可是结果一直不好。
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)

[交流] 我在做融合pcr，可是结果一直不好。

我在做融合pcr，左边的四个是一个2600bp和一个1100bp的融合...marker后面，也就是右边的四个，做的是两个1100bp左右的融合…可是……左边的总是点样孔很亮，可是，目的片段很弱。右边的，整体就没有条带。应该怎么办？

我在做融合pcr，可是结果一直不好。


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青大好汉

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1楼 2017-03-14 10:28:53
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yt7777

金虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by yt7777 at 2017-03-15 00:03:22
做个梯度吧  摸一下条件

做个Tm梯度摸一下Tm，建议最好是确定两个片段都p出来了，做一个纯化，然后进行第二轮pcr

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12楼2017-03-17 23:38:06
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borrysa

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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19楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-18 01:45:27
你在国外呀？好厉害的说。。。我一直在头疼我这个融合PCR，总是睡不好。
...

没事，我之前也一直在做overlapping pcr，咱们可以交流下

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20楼2017-03-18 01:47:20
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青大好汉

银虫 (小有名气)
★
づ迷糊ぷ娃娃(金币+1): 谢谢参与
我也是哎，解决了吗，楼主
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2楼2017-03-14 13:40:56
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渭城朝风

新虫 (初入文坛)
★
づ迷糊ぷ娃娃(金币+1): 谢谢参与
重叠PCR吧，先把两条片段和扩增出来，在以此为模板，在融合PCR，不要模板太多
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3楼2017-03-14 15:17:55
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)
★
づ迷糊ぷ娃娃(金币+1): 谢谢参与
觉得差不多大小的位置切胶回收，再用两端的引物重新PCR一下。
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4楼2017-03-14 23:27:59
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borrysa

金虫 (正式写手)
★
づ迷糊ぷ娃娃(金币+1): 谢谢参与
或者用touch downPcr试试

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5楼2017-03-14 23:51:54
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yt7777

金虫 (小有名气)
★
づ迷糊ぷ娃娃(金币+1): 谢谢参与
做个梯度吧  摸一下条件

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6楼2017-03-15 00:03:22
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 青大好汉 at 2017-03-14 13:40:56
我也是哎，解决了吗，楼主

没有解决呢。。。愁死了

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7楼2017-03-17 14:50:45
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-14 23:51:54
或者用touch downPcr试试

我不太了解，是什么意思

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8楼2017-03-17 14:51:00
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yt7777 at 2017-03-15 00:03:22
做个梯度吧  摸一下条件

做哪些条件的梯度，是退火温度和模板的量么？

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9楼2017-03-17 14:51:38
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渭城朝风 at 2017-03-14 15:17:55
重叠PCR吧，先把两条片段和扩增出来，在以此为模板，在融合PCR，不要模板太多

是这么做的，模板的话，长的一个片段2微升，短的片段3微升

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10楼2017-03-17 14:52:36
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-03-14 23:27:59
觉得差不多大小的位置切胶回收，再用两端的引物重新PCR一下。

感觉量少的可怜，等回收出来，是不是就回收丢了。。。而且，回来出来的话，再做模板的时候加多少量呢，，会不会太少了

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11楼2017-03-17 14:53:37
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borrysa

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-17 14:51:00
我不太了解，是什么意思
...

就是说先P 5-10cycle 用高一点的退火温度，后面用低一点的温度。

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13楼2017-03-18 00:53:36
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 00:53:36
就是说先P 5-10cycle 用高一点的退火温度，后面用低一点的温度。
...

那我用把前10个循环的产物回收吗？还是直接拿来当模板？？？

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14楼2017-03-18 01:00:38
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borrysa

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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14楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-18 01:00:38
那我用把前10个循环的产物回收吗？还是直接拿来当模板？？？
...

直接跑，像下图这样设程序
我在做融合pcr，可是结果一直不好。-1



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15楼2017-03-18 01:42:26
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:42:26
直接跑，像下图这样设程序

...

我试试，谢谢

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16楼2017-03-18 01:43:31
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:42:26
直接跑，像下图这样设程序

...

竟然还没睡~

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17楼2017-03-18 01:43:45
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borrysa

金虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-18 01:43:45
竟然还没睡~
...

北美时间啊！

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18楼2017-03-18 01:44:33
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:44:33
北美时间啊！
...

你在国外呀？好厉害的说。。。我一直在头疼我这个融合PCR，总是睡不好。

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19楼2017-03-18 01:45:27
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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20楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:47:20
没事，我之前也一直在做overlapping pcr，咱们可以交流下
...

可是感觉看你设置的Tm值真的好高，我们一般都是55℃，所以我不知道前十个循环应该设置多少度了

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21楼2017-03-18 01:49:03
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borrysa

金虫 (正式写手)
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21楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-18 01:49:03
可是感觉看你设置的Tm值真的好高，我们一般都是55℃，所以我不知道前十个循环应该设置多少度了
...

那要根据你的基因噢，一般是应该用低一点的温度，但是我的基因GC 含量极高，低温扩不出来。

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22楼2017-03-18 01:51:09
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づ迷糊ぷ娃娃

新虫 (初入文坛)
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22楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:51:09
那要根据你的基因噢，一般是应该用低一点的温度，但是我的基因GC 含量极高，低温扩不出来。
...

谢谢你哦，我明天去了实验室就试试。然后引物的话就是加融合上游片段的5'引物，和融合下游的3'端引物，对不？

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23楼2017-03-18 01:55:03
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borrysa

金虫 (正式写手)
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23楼: Originally posted by づ迷糊ぷ娃娃 at 2017-03-18 01:55:03
谢谢你哦，我明天去了实验室就试试。然后引物的话就是加融合上游片段的5'引物，和融合下游的3'端引物，对不？
...

是的！

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24楼2017-03-18 02:05:49
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萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
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你好！最近在做融合pcr，已经得到了待融合的两个片段，请问该怎么建立接下来的融合反应体系呢？谢谢了 ！
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25楼2017-03-25 16:19:30
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萌萌笑笑

金虫 (正式写手)
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20楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-18 01:47:20
没事，我之前也一直在做overlapping pcr，咱们可以交流下
...

您好！最近在做融合PCR，目前已经得到待融合片段，但不知道接下来该如何设置反应的体系和PCR程序，希望可以得到您的指导，谢谢啦 ！
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26楼2017-03-25 16:23:00
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青大好汉

银虫 (小有名气)
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送红花一朵
左侧融合PCR点样空处很亮，跟我的一样，楼主解决了吗？
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27楼2017-03-31 16:18:17
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杨大头007

新虫 (初入文坛)
★
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27楼: Originally posted by 青大好汉 at 2017-03-31 16:18:17
左侧融合PCR点样空处很亮，跟我的一样，楼主解决了吗？

我做融合PCR时也出现了加样孔很亮的情况，怎么回事，你的解决了吗？
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28楼2017-04-24 09:13:28
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