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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有提土壤DNA的好方法吗？
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annwt

木虫 (正式写手)

[交流] 有提土壤DNA的好方法吗？

近来提土壤DNA屡遭失败，不知谁有好方法，介绍介绍，先感谢参与的大家了！！！
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1楼 2008-12-25 07:35:04
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pzhan1982

金虫 (著名写手)
无外乎有蛋白质、酚、RNA的污染。
一步步的提纯！
要是有钱的话，可以买试剂盒提！
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2楼2008-12-25 09:49:47
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maomao1426

木虫 (著名写手)
试剂盒了
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3楼2008-12-25 09:54:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
去查周集中的方法去　
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2008-12-25 11:39:43
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gaofeicas

新虫 (初入文坛)
试剂盒吧，不过挺贵的
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5楼2008-12-25 14:18:40
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蓝色基因

金虫 (正式写手)
周集中的方法，正好我硕士论文里面有：

①        15d细菌培养物，取固液混合样10ml用0.22μm微孔滤膜过滤，滤余物与3 g干热灭菌的沙子一起倒入研钵，加入液氮反复研磨；
②        将研磨后的样品与沙子混合物转移至50 mL离心管中，加DNA抽提缓冲液13.5 mL，加入50 μL蛋白酶K，37℃水浴30 min；
③        加1.5 mL SDS并轻轻摇动混匀。65℃水浴2个小时，期间每隔15～30分钟摇动一次；
④        4000 r/min离心5 min。转移上清液到一个新的离心管中；
⑤        往管底沉淀再加4.5 mL缓冲液和0.5 mL SDS，混匀,65℃水浴15 min。4000 r/min离心5 min。收集上清液倒入先前的离心管；
⑥        重复步骤○5一次；
⑦        在装有上清液的离心管中倒入等体积的氯仿。3900 r/min离心20 min；
⑧        重复步骤○7一次；
⑨        收集上清液，加入0.6倍体积的2-异丙醇。室温静置1h或静置过夜。
⑩        将静置或过夜样品11000 r/min离心45 min，倒掉上清液，加入5 mL 70%乙醇，用枪头轻轻吸打均匀；
⑪        4000 r/min离心15 min，倒掉上清液。加入200～500 μL单蒸水后于65℃水浴一段时间溶解；
⑫        对DNA初提产物进行纯化后，转移至EP管中于－20ºC保存。
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6楼2008-12-27 11:08:40
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annwt

木虫 (正式写手)
The pellet of crude nucleic acids was obtained by centrifugation at 16,000
g for 20 min at room temperature,


为什么需要16000g？普通植物提DNA12000g就可以。植物的DNA也是20kb左右。

[ Last edited by annwt on 2008-12-27 at 16:11 ]
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7楼2008-12-27 16:08:57
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house

银虫 (正式写手)
土壤DNA提取关键是污染物的去除，一般需要的是PVPP或是PVP（聚乙烯聚吡咯烷酮）。

  周的方法只是一般的提取DNA的方法，用于土壤DNA的话成功率不高。
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8楼2008-12-27 17:37:22
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by house at 2008-12-27 17:37:
土壤DNA提取关键是污染物的去除，一般需要的是PVPP或是PVP（聚乙烯聚吡咯烷酮）。

  周的方法只是一般的提取DNA的方法，用于土壤DNA的话成功率不高。

我用还没有失败过呢，不过提取出来的DNA呈褐色甚至深褐色，要酶切或者PCR的话要纯化。
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9楼2008-12-28 00:23:26
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annwt

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 微笑漩涡 at 2008-12-28 00:23:



我用还没有失败过呢，不过提取出来的DNA呈褐色甚至深褐色，要酶切或者PCR的话要纯化。

我也提出褐色的沉淀物，溶解后跑电泳没有东西，很是纳闷，难道溶解需要很长时间吗？
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10楼2008-12-28 09:15:01
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