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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助大神，分子基础薄弱 引物设计扩不出来!
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艾喵喵

木虫 (正式写手)

[交流] 求助大神，分子基础薄弱 引物设计扩不出来!

我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG

设计的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC   TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位点 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

                   R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位点 NotI    GC含量54.5%   TM值68.7


前后引物均加酶切位点和保护碱基 尝试过退火温度58-64均没有P出来目的条带还尝试过55度也没有p出来  不知道是什么原因

求各位大神指点，小妹不胜感激！
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1楼 2017-02-25 17:31:16
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莫等闲111

版主 (知名作家)
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-26 08:55:19
设计的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC   TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位点 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

                   R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位点 NotI    GC含量54.5%   TM值68.7
你的引物设计的有问题  比如说R:5端 加酶切位点前后都加了保护碱基 ，而且你的保护碱基貌似也不对，有相应的表的，http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy；
我感觉可以设计成这样R：5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC  CTTCCACTCCTTCTGC 3-；同理F也一样。
另外注意               (1)酶及其浓度；
                           (2)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一；
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5楼2017-02-25 18:00:54
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-02-25 18:00:54
设计的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC   TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位点 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

                   R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位点 NotI    GC含量 ...

谢谢你，我的下游引物的保护碱基是按照一个硕士论文里添加的，我看他也用了NotI这个酶切位点

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7楼2017-02-25 18:08:15
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雁回首

新虫 (初入文坛)
★
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
我是来学习的，小白一个刚接触

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31楼2017-02-25 19:33:54
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598878157

版主 (文学泰斗)
★
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34楼2017-02-25 20:26:36
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 雁回首 at 2017-02-25 19:33:54
我是来学习的，小白一个刚接触

可以切磋一下

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37楼2017-02-25 21:00:46
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winteran

新虫 (小有名气)
★
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
你这基因不像CDS区啊

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42楼2017-02-25 21:22:04
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
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45楼2017-02-25 21:24:25
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
44楼: Originally posted by 哈哈狂风暴雨 at 2017-02-25 21:24:15

怎么了？

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47楼2017-02-25 21:26:42
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
42楼: Originally posted by winteran at 2017-02-25 21:22:04
你这基因不像CDS区啊

我这是全长CDS截取了一部分

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48楼2017-02-25 21:27:18
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艾喵喵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 皖北+ at 2017-02-25 19:11:33

不要抱抱，要帮助

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50楼2017-02-25 21:28:44
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