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艾喵喵

木虫 (正式写手)

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[交流] 求助大神，分子基础薄弱引物设计扩不出来!

我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG

设计的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位点 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

               R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7

前后引物均加酶切位点和保护碱基尝试过退火温度58-64均没有P出来目的条带还尝试过55度也没有p出来  不知道是什么原因

求各位大神指点，小妹不胜感激！

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1楼 2017-02-25 17:31:16

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莫等闲111

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★ ★ ★ ★
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-26 08:55:19

设计的引物  F:5'  AGACCG  GAATTC  CGGACC TTGGACAACGCCTTC  3' 酶切位点 EcoRI  GC含量57.6%  TM值70.1

               R:5'  ATT  GCGGCCGC  TTA  TCA  CTTCCACTCCTTCTGC  3'  酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7
你的引物设计的有问题  比如说R:5端加酶切位点前后都加了保护碱基，而且你的保护碱基貌似也不对，有相应的表的，http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy；
我感觉可以设计成这样R：5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC  CTTCCACTCCTTCTGC 3-；同理F也一样。
另外注意             (1)酶及其浓度；
                        (2)模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一；

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5楼2017-02-25 18:00:54

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艾喵喵

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-02-25 18:00:54
设计的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位点 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1

R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位点 NotI GC含量 ...

谢谢你，我的下游引物的保护碱基是按照一个硕士论文里添加的，我看他也用了NotI这个酶切位点

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7楼2017-02-25 18:08:15

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