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纪孟君

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助克隆 已有4人参与

各位大神,我的目的基因是2000左右,我连T载体做转化,菌长得也挺好,可是菌液PCR啥都没有,这是没连上吗??求大神指点
还想求助下大神们平时用的克隆载体有哪些

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小冀-

版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-02-25 10:13:19
有可能,T载体很容易出问题,可能是自连了,不过也可能是菌液pcr那步菌体太多,没P出来~你可以挑一两个点提个质粒,酶切鉴定一下,有可能是对的~
···
2楼2017-02-25 09:18:44
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as1688816

木虫 (正式写手)

对照要好,ta克隆确实不好做,我想应该和自身片段的加a效率也有关系,这个可能和用的扩增酶有关,我之前做的阳性对照百分百连上,但是目的片段就是连不上或者连接效率低

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4楼2017-02-25 15:42:23
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纪孟君

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2017-02-25 09:18:44
有可能,T载体很容易出问题,可能是自连了,不过也可能是菌液pcr那步菌体太多,没P出来~你可以挑一两个点提个质粒,酶切鉴定一下,有可能是对的~

酶切了,证明没连上,准备提高DNA浓度,重新连(?? . ??)

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7楼2017-02-25 16:55:29
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普通回帖

纪孟君

新虫 (初入文坛)

想问一下你们平时用啥载体

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大雨也要等到晴朗
3楼2017-02-25 10:27:28
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as1688816

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 纪孟君 at 2017-02-25 10:27:28
想问一下你们平时用啥载体

我用的是pmd18t

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5楼2017-02-25 15:43:45
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纪孟君

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by as1688816 at 2017-02-25 15:43:45
我用的是pmd18t
...

我用的是pMD19t载体,我平时用的是16°过夜连接,怎么都连不上

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大雨也要等到晴朗
6楼2017-02-25 16:53:35
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

引用回帖:
7楼: Originally posted by 纪孟君 at 2017-02-25 16:55:29
酶切了,证明没连上,准备提高DNA浓度,重新连(?? . ??)
...

好吧,祝好运

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···
8楼2017-02-25 16:56:13
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timberstar

新虫 (初入文坛)

菌长得很好,但是没有P出来,如果PCR条件一切正确,那就说明是假阳性,这种情况,很大程度上是酶切没有切好,头没有切开,连接不上,或者极少部分连接,导致假阳性太多!好好切吧,加大酶切浓度,延长酶切时间。祝你好运

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9楼2017-02-26 07:43:23
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
T载体连接,最主要的就是载体和目标片段的浓度比例了,比例不合适是很难做出来的。
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索
10楼2017-02-26 09:54:34
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