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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切、连接、转化求助
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forget1997

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切、连接、转化求助

我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：
（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？
（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。
（3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？
（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？
（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？
（6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？
（7）转染一般多少次重复？
（8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？
(9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？

Thanks！

[ Last edited by forget1997 on 2008-12-18 at 14:07 ]
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1楼 2008-12-18 12:15:45
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yhxiang

金虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
（1)酶切前后都要 胶回收
（2）0.5ul
（3）可以
（4)1ul Takara的T4连接酶
（5）连接之后直接转化，不需要纯化
（6）（7）98)我没做过，
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向往从容淡定的生活
2楼2008-12-18 14:13:21
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suguang

铜虫 (初入文坛)
★ ★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？  要
（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。     按酶的活性单位和你酶切产物的量，适当加大用量或酶切时间
（3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？  参考酶公司提供的目录上的双酶切使用Buffer列表
（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？  按各个酶的说明书，可适当加大酶量和连接时间
（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？  一般不需要纯化，连接产物直接可以转化，也可以醇沉后转化
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3楼2008-12-18 14:17:13
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bbyu007

木虫 (正式写手)
★ ★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考：
（1）PCR之后、酶切之前   这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。其次，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提去质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。
（2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。
（3）加0.5 ul。
（4）不用提纯，直接转化。
以下请高手继续解答。
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我是笨笨鱼~~~
4楼2008-12-18 14:22:49
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bbyu007

木虫 (正式写手)
我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考：
（1）PCR之后、酶切之前   这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。然后，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提取质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。
（2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。
（3）可以。
（4）加0.5 ul。
（5）不用提纯，直接转化。
以下请高手继续解答。
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我是笨笨鱼~~~
5楼2008-12-18 14:26:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
forget1997(金币+1,VIP+0):3Q!
（6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？-------Invitrogen的lipo 2000咯，很经典，HepG2还是可以用这个转的
（7）转染一般多少次重复？--------24孔设3个复孔，96孔至少6个
（8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？----------24孔都可以，看你要做的下游实验是什么。western的话60皿，纯看形态24孔板
(9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？---------绝对要！无论做什么操作，如传代、换液等，都要预热培养基
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6楼2008-12-18 18:12:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
（2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。
-------以上所有答多少ul的酶的答案都是不到位的。按照NEB的体系，50ul一般需要2个单位内切酶。这里的50ul是含有≤2ug的质粒DNA。根据酶活定义，一小时消化1ug DNA为一个单位。

（4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？
-----------同（2），是需要根据酶活定义来看的。建议使用快速连接kit

（5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？
-----------化学感受态是不需要的

这里的任何一种工具酶都不要用takara的。内切酶星号活性严重，酶活低，T4酶活也很低。
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7楼2008-12-18 18:18:28
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1yangz

新虫 (初入文坛)
真是很受帮助
小虫初来！
谢谢！
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8楼2008-12-18 20:31:48
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mixy

铜虫 (初入文坛)
takara的内切酶还好，酶切效率挺不错的，就是千万不要加太多了，50ul的体系双酶切每种酶加1ul即可，不可过多。连接酶，takara的效率不是很高，建议用全氏金的，10分钟即可连接完成。
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9楼2009-01-07 01:23:14
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study236

银虫 (小有名气)
谢谢各位了，我也学习学习
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10楼2009-01-08 13:50:21
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