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酶切、连接、转化求助
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我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家： （1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ （6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？ （7）转染一般多少次重复？ （8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？ (9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？ Thanks！ [ Last edited by forget1997 on 2008-12-18 at 14:07 ] |
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2楼2008-12-18 14:13:21
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（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ 要 （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 按酶的活性单位和你酶切产物的量，适当加大用量或酶切时间 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ 参考酶公司提供的目录上的双酶切使用Buffer列表 （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ 按各个酶的说明书，可适当加大酶量和连接时间 （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ 一般不需要纯化，连接产物直接可以转化，也可以醇沉后转化 |
3楼2008-12-18 14:17:13
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我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考： （1）PCR之后、酶切之前 这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。其次，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提去质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。 （2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。 （3）加0.5 ul。 （4）不用提纯，直接转化。 以下请高手继续解答。 |
4楼2008-12-18 14:22:49
bbyu007
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（6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？-------Invitrogen的lipo 2000咯，很经典，HepG2还是可以用这个转的 （7）转染一般多少次重复？--------24孔设3个复孔，96孔至少6个 （8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？----------24孔都可以，看你要做的下游实验是什么。western的话60皿，纯看形态24孔板 (9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？---------绝对要！无论做什么操作，如传代、换液等，都要预热培养基 |
6楼2008-12-18 18:12:49
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