| 查看: 1735 | 回复: 15 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
酶切、连接、转化求助
|
|||
|
我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家： （1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ （6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？ （7）转染一般多少次重复？ （8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？ (9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？ Thanks！ [ Last edited by forget1997 on 2008-12-18 at 14:07 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
今天系统多次维护，明天很可能放榜！
已经有5人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有74人回复
-
岩土工程学报什么时候才能终审完呐
已经有4人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有25人回复
-
2027广东省杰青
已经有6人回复
-
快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。
已经有3人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有9人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有26人回复
-
我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人
已经有16人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有12人回复
9楼2009-01-07 01:23:14
2楼2008-12-18 14:13:21
★ ★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
|
（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ 要 （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 按酶的活性单位和你酶切产物的量，适当加大用量或酶切时间 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ 参考酶公司提供的目录上的双酶切使用Buffer列表 （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ 按各个酶的说明书，可适当加大酶量和连接时间 （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ 一般不需要纯化，连接产物直接可以转化，也可以醇沉后转化 |
3楼2008-12-18 14:17:13
bbyu007
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2018.2
- 散金: 99
- 红花: 1
- 帖子: 348
- 在线: 20.8小时
- 虫号: 482918
- 注册: 2007-12-26
- 性别: GG
★ ★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
lwf991229(金币+1,VIP+0):3Q~
|
我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考： （1）PCR之后、酶切之前 这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。其次，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提去质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。 （2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。 （3）加0.5 ul。 （4）不用提纯，直接转化。 以下请高手继续解答。 |
4楼2008-12-18 14:22:49
25