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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » T4连接求助
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biogefart

木虫 (著名写手)

[交流] T4连接求助

我的双酶切·连接一直出状况。我的体系一般用7ul目的片段，3ul载体，2ul takara的T4，1.33ul，buffer。酶切后胶回收用的是qiagen的试剂盒，回收浓度只有10ng/ul左右。4度连接。连接后很多次没有菌落，虽然偶尔会得到阳性克隆，但是数量极少，给我现在和以后的工作造成很大困扰。现在连接前肯定会做连接酶的活性测定，保证没有问题，其次感受态连接前也测试过。请各位给点建设性的意见，其他建议比如连接目的片段和载体的比例我都测过，对我的结果并没有什么改观。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-2 at 15:17 ]
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闹太套
1楼 2008-12-16 14:33:20
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bbyu007

木虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
我一般都是用10ul的连接体系：6ul目的片段，2.5ul载体，0.5ul takara的T4，1ul的buffer，16°C过夜。每次效果都不错，你试试吧。
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我是笨笨鱼~~~
2楼2008-12-16 15:28:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
酶切后不要再切胶回收了，用PCR清洁试剂盒洗洗就好了
跑个胶损失很大
虽然只有这么低的浓度，但是还是能做实验的
我不用takara的T4，因为确实很垃圾……
同样是日货的TOYOBO快速连接kit效果非常好，黏端真的几分钟就连好了~~
平端30min也连上
fmol级别的都能连~~~
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3楼2008-12-16 16:14:59
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yhxiang

金虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
我们用全式金的T4连接酶，25度连接10－30分钟，效果一直不错。你说的克隆少是不是你的载体加的太少了？适当增加一下载体的量试试
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向往从容淡定的生活
4楼2008-12-17 19:52:10
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maxingyi

木虫 (正式写手)

小马求学
全式金的T4连接酶，建议这个
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千里马常有
5楼2008-12-17 22:25:54
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mixy

铜虫 (初入文坛)
全氏金的T4连接酶很强大，每次效果都很不错，20-25度均可，10分钟就好。曾试过用全氏金的连接酶连30分钟，效果反而不好……
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6楼2009-01-07 01:28:17
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Alexis

铜虫 (小有名气)
宝生物的T4也好用，16度连接1h即可
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7楼2009-01-10 21:14:28
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myloverlr

金虫 (小有名气)
我用金斯特的酶，16度2h也没连接上。连接体系是目的片段11微、载体6微、10倍的buffer2微、T4连接酶1微。转化时200微升的感受态细胞一般加多少连接液啊？
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8楼2009-04-08 12:55:51
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Biohydrogen

金虫 (正式写手)
我觉得可能是浓度太低，也可能是感受态细菌不好。首先提高浓度试试，提高到30ng/uL效果会好很多
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9楼2009-04-08 14:05:39
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yaoguizhe

铁虫 (初入文坛)
载体我一般用1ul,目的基因可以用多点。16℃过夜我用的是25ul体系，1ul的酶
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10楼2009-04-09 09:57:42
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