应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » T4连接求助
51/1返回列表
查看: 1503  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

biogefart

木虫 (著名写手)

[交流] T4连接求助

我的双酶切·连接一直出状况。我的体系一般用7ul目的片段，3ul载体，2ul takara的T4，1.33ul，buffer。酶切后胶回收用的是qiagen的试剂盒，回收浓度只有10ng/ul左右。4度连接。连接后很多次没有菌落，虽然偶尔会得到阳性克隆，但是数量极少，给我现在和以后的工作造成很大困扰。现在连接前肯定会做连接酶的活性测定，保证没有问题，其次感受态连接前也测试过。请各位给点建设性的意见，其他建议比如连接目的片段和载体的比例我都测过，对我的结果并没有什么改观。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-2 at 15:17 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
闹太套
1楼 2008-12-16 14:33:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaoguizhe

铁虫 (初入文坛)
载体我一般用1ul,目的基因可以用多点。16℃过夜我用的是25ul体系，1ul的酶
赞一下 回复此楼
10楼2009-04-09 09:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

bbyu007

木虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
我一般都是用10ul的连接体系：6ul目的片段，2.5ul载体，0.5ul takara的T4，1ul的buffer，16°C过夜。每次效果都不错，你试试吧。
赞一下(10人) 回复此楼
我是笨笨鱼~~~
2楼2008-12-16 15:28:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
酶切后不要再切胶回收了，用PCR清洁试剂盒洗洗就好了
跑个胶损失很大
虽然只有这么低的浓度，但是还是能做实验的
我不用takara的T4，因为确实很垃圾……
同样是日货的TOYOBO快速连接kit效果非常好，黏端真的几分钟就连好了~~
平端30min也连上
fmol级别的都能连~~~
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2008-12-16 16:14:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yhxiang

金虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~~
我们用全式金的T4连接酶，25度连接10－30分钟，效果一直不错。你说的克隆少是不是你的载体加的太少了？适当增加一下载体的量试试
赞一下(10人) 回复此楼
向往从容淡定的生活
4楼2008-12-17 19:52:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 uKOSCocCb6Fm 2026-11-13 3/150 2026-11-15 04:05 by xSrQNSSjcgoX
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 uKOSCocCb6Fm 2026-11-12 7/350 2026-11-15 03:43 by xSrQNSSjcgoX
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 FChKX8meu1ds 2026-11-09 8/400 2026-11-15 00:35 by Equinoxhua
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 SX5mJmPWDfOO 2026-11-13 3/150 2026-11-14 13:46 by KXypaGgBBlw7
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 gRND4NVAZ8VG 2026-11-11 5/250 2026-11-13 11:15 by Equinoxhua
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-13 11:13 by Equinoxhua
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 5/250 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 TgvkbZZl9tqB 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:26 by ECLTXnJnRSXf
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 5/250 2026-11-12 11:14 by HajghKOMynmz
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 czAiolzR0IJC 2026-11-10 7/350 2026-11-12 11:11 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 7/350 2026-11-12 10:49 by HajghKOMynmz
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 7/350 2026-11-12 10:16 by HajghKOMynmz
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 YHiw1gou1Eda 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:08 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +8 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 12/600 2026-11-12 09:32 by HajghKOMynmz
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cdqGD6ftHmbl 2026-11-11 3/150 2026-11-12 07:53 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 czAiolzR0IJC 2026-11-10 5/250 2026-11-12 06:25 by 9fOTqj074tIg
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 FChKX8meu1ds 2026-11-09 7/350 2026-11-12 05:19 by 9fOTqj074tIg
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 FChKX8meu1ds 2026-11-09 6/300 2026-11-11 17:03 by TgvkbZZl9tqB
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭