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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切、连接求助
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forget1997

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切、连接求助

我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：
（1）酶切之后，是否要用SAP去掉磷酸集团？有的文献说要，但是有的说不用。
（2）酶切的时候，大家一般用多少体系？似乎大部分人都用50-100ul。
（3）连接的时候，PCR产物、pGL质粒比例一般是3-10：1.这个比例是摩尔数比还是DNA总量之比？
（4）HepG2细胞，我看有人用RPMI1640养，有人用DMEM养。不同的培养基，是否会对最终结果有影响？
（5）转染的时候，对细胞数是否有要求？
Thanks！
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1楼 2008-12-15 07:57:36
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
forget1997(金币+2,VIP+0):Thanks!
1、酶切后有自连的可能性（如切出来是双平端），就要载体去磷酸化防止自连
2、50足矣，前提是质粒、片段浓度够高，还有清洁试剂盒回收率高
3、摩尔比
4、这个就很难讲了，你一直用什么养就接着用什么养吧，中途换培养基是绝对会影响的
5、有，不同转染试剂有不同要求。看说明书或者问他人经验。宁可种稀一点然后让它长，把握个转染浓度。不要一开始种太密结果一转就死了。
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2楼2008-12-15 08:53:00
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forget1997

银虫 (小有名气)
谢谢楼上的。

我用的是粘性末端，也要去磷酸化吗？去磷酸化，是用SAP吗？
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3楼2008-12-15 10:09:08
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richart

金虫 (正式写手)
★
forget1997(金币+1,VIP+0):thanks!
去磷酸化后自连效率低，不去也没关系，双酶切一般没问题的。去磷酸化没什么影响，反正我从不做这一步，连接挺好的。
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4楼2008-12-15 10:56:34
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forget1997

银虫 (小有名气)
我又看到一个问题：
没有转染质粒的细胞（不是细菌），能生存下来吗？
FuGene说可以加入一些东西，使得没有转染的细胞死掉。这是如何实现的？
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5楼2008-12-15 12:49:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
forget1997(金币+1,VIP+0):3x!
一般的话，质粒上有抗性基因，可以用于筛选
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6楼2008-12-15 13:09:48
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