应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切、连接求助
51/1返回列表
查看: 552  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

forget1997

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切、连接求助

我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家：
（1）酶切之后，是否要用SAP去掉磷酸集团？有的文献说要，但是有的说不用。
（2）酶切的时候，大家一般用多少体系？似乎大部分人都用50-100ul。
（3）连接的时候，PCR产物、pGL质粒比例一般是3-10：1.这个比例是摩尔数比还是DNA总量之比？
（4）HepG2细胞，我看有人用RPMI1640养，有人用DMEM养。不同的培养基，是否会对最终结果有影响？
（5）转染的时候，对细胞数是否有要求？
Thanks！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-12-15 07:57:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

forget1997

银虫 (小有名气)
我又看到一个问题：
没有转染质粒的细胞（不是细菌），能生存下来吗？
FuGene说可以加入一些东西，使得没有转染的细胞死掉。这是如何实现的？
赞一下 回复此楼
5楼2008-12-15 12:49:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
forget1997(金币+2,VIP+0):Thanks!
1、酶切后有自连的可能性（如切出来是双平端），就要载体去磷酸化防止自连
2、50足矣，前提是质粒、片段浓度够高，还有清洁试剂盒回收率高
3、摩尔比
4、这个就很难讲了，你一直用什么养就接着用什么养吧，中途换培养基是绝对会影响的
5、有，不同转染试剂有不同要求。看说明书或者问他人经验。宁可种稀一点然后让它长，把握个转染浓度。不要一开始种太密结果一转就死了。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2008-12-15 08:53:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

forget1997

银虫 (小有名气)
谢谢楼上的。

我用的是粘性末端，也要去磷酸化吗？去磷酸化，是用SAP吗？
赞一下 回复此楼
3楼2008-12-15 10:09:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

richart

金虫 (正式写手)
★
forget1997(金币+1,VIP+0):thanks!
去磷酸化后自连效率低，不去也没关系，双酶切一般没问题的。去磷酸化没什么影响，反正我从不做这一步，连接挺好的。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2008-12-15 10:56:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 XJXMuRjD7cK7 2026-11-13 3/150 2026-11-13 23:37 by 6PrO1XyZ5URF
[考博] 考博求助 10+3 社会实践对别 2026-11-08 3/150 2026-11-13 14:04 by 沐小虫252
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 1Nb0IVlmV6v0 2026-11-11 4/200 2026-11-13 11:18 by Equinoxhua
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 FChKX8meu1ds 2026-11-09 10/500 2026-11-13 11:08 by Equinoxhua
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +6 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 7/350 2026-11-13 10:55 by Equinoxhua
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 7/350 2026-11-12 11:31 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 8/400 2026-11-12 11:22 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 czAiolzR0IJC 2026-11-10 9/450 2026-11-12 11:00 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 7/350 2026-11-12 10:49 by HajghKOMynmz
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 G2rhSvqvhNzl 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:38 by HajghKOMynmz
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 6/300 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 8/400 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +7 FChKX8meu1ds 2026-11-09 12/600 2026-11-12 09:43 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-12 09:21 by HajghKOMynmz
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 5/250 2026-11-12 06:03 by 9fOTqj074tIg
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 YHiw1gou1Eda 2026-11-10 7/350 2026-11-12 05:41 by 9fOTqj074tIg
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 8/400 2026-11-12 05:00 by 9fOTqj074tIg
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-12 04:57 by 9fOTqj074tIg
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 7/350 2026-11-12 00:44 by 9fOTqj074tIg
[文学芳草园] 厉娜 +3 张丹枫1991 2026-11-09 5/250 2026-11-09 16:53 by 张丹枫1991
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭