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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 连接转化
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豆豆逗儿

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化 已有7人参与

连接转化，最后检测什么都没有，菌落也长了……就是跑带的时候……什么都没有……好多次了……不知道怎么回事……求大神们指教……

连接转化


连接转化-1


@飞约疯人院 @biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2017-01-17 21:53:28
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yt7777

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-19 07:49:06
可能是pcr时加入的菌液浓度过高，另外楼主的点样孔除了marker都很亮，可能是试剂有污染，，，，最后：制板时已加入抗性前提下，涂板的时候可以再适当加点抗生素，然后加入菌液涂板，阳性概率会得到提升，，，，，以上纯属个人愚见。。。
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6楼2017-01-18 00:54:49
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-19 07:50:34
上样孔非常亮，说明基因组DNA浓度很高，就是说你的模板加太多了，之前把浓度降低十倍才行。正常菌落pcr几乎不会在上样孔里看见条带的。

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7楼2017-01-18 01:15:53
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fudan671

木虫 (著名写手)
应该判定没有连入，其次可以增加抗生素浓度。

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豆豆逗儿
8楼2017-01-18 07:26:53
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 豆豆逗儿 at 2017-01-17 22:41:45
直接提取质粒，也许会出来？
...

嗯，如果连上了的话。菌液条带不明显也是可能的。但是这种情况只报侥幸心理哦。做分子还是每一步都确保正确比较省事，不然后面太费劲，最终做不走。

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5楼2017-01-17 23:39:36
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shaoxin816

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
17楼: Originally posted by 豆豆逗儿 at 2017-01-18 20:42:59
没有……师兄说没必要做……就一直没做……
...

对照肯定要做！必须做！你做一次对照，要是backbone对照也长出克隆。说明 没切开

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豆豆逗儿
18楼2017-01-19 21:15:45
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普通回帖

小虫虫fly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 豆豆逗儿 at 2017-01-17 21:53:28
连接转化，最后检测什么都没有，菌落也长了……就是跑带的时候……什么都没有……好多次了……不知道怎么回事……求大神们指教……


...

没有连上应该是，之前也遇到过这种情况

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2楼2017-01-17 22:03:18
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Rdan

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-19 07:49:29
菌液pcr没有条带，那大概就没有连上，如果一直这样也可以随机挑两管提质粒试试吧，我之前也这样，发现质粒条带是对的，测序也是对的。至于为什么会这样，我也刚涉足不太清楚

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豆豆逗儿
3楼2017-01-17 22:34:44
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豆豆逗儿

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by Rdan at 2017-01-17 22:34:44
菌液pcr没有条带，那大概就没有连上，如果一直这样也可以随机挑两管提质粒试试吧，我之前也这样，发现质粒条带是对的，测序也是对的。至于为什么会这样，我也刚涉足不太清楚
...

直接提取质粒，也许会出来？

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4楼2017-01-17 22:41:45
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浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-19 07:49:55
也有可能是产物不纯，有蛋白缠绕着产物堵在了上样孔，你跑胶的loading buffer里有没有SDS，没有的话可以加一点SDS看看有没有条带跑出来
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豆豆逗儿
9楼2017-01-18 10:16:45
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豆豆逗儿

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 浮笙若梦 at 2017-01-18 10:16:45
也有可能是产物不纯，有蛋白缠绕着产物堵在了上样孔，你跑胶的loading buffer里有没有SDS，没有的话可以加一点SDS看看有没有条带跑出来

嗯，从头做起……试一下吧

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10楼2017-01-18 11:13:11
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