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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR用试剂盒做做实时荧光PCR阴性总是有污染。。。求助
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yuer_

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR用试剂盒做做实时荧光PCR阴性总是有污染。。。求助 已有2人参与

用的HBV试剂盒做标准曲线，阴性总是有抬头，实验室有污染 已经换地方做了，移液枪都拆了用75%乙醇洗过了 不过没有用高压灭菌。阴性抬头很高，Ct值都快赶上3次方了，
实验室紫外也照了 通风有在做，每次做实验最后加样的时候也会换手套。然后拿纯水代替阴性做了一下试了下没有荧光。不知道这个有没有意义。是不是可以排除枪、枪头、交叉或者操作过程中的其他污染？
新手做pcr没经验很多不懂 求助求助
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1楼 2017-01-16 08:53:08
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
日积月累产物的污染，你可以考虑换个别的厂家的试剂盒做做吧
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yuer_
2楼2017-01-16 09:20:04
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yuer_

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2017-01-16 09:20:04
日积月累产物的污染，你可以考虑换个别的厂家的试剂盒做做吧

换试剂盒厂家这个我这里也是不太可能了 只能尽可能 的避免污染了。
还有 能问下我把纯水代替阴性血清来检查枪头、操作污染有意义吗？
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3楼2017-01-16 10:10:23
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yuer_

新虫 (初入文坛)
今天把阴性血清和纯水与3、4、5、6次方浓度的标准品分开处理，污染有略微减少但还是存在。。。郁闷 求大神
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4楼2017-01-16 16:52:12
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
多少个重复，确定纯水就没有污染？而不是概率事件？如果是，考虑下是不是提取污染。这个发生率很高。如果是提取发生污染，你换个厂家的试剂盒一样出，可以作为验证。

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核酸提取与Taqman诊断
5楼2017-01-16 18:07:08
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能试剂污染，有些牌子的试剂就是不好
PCR的污染物无非就是DNA模板，你认为酒精可以灭活DNA吗？
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6楼2017-01-17 13:07:59
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuer_: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-01-18 09:38:34
1、HBV荧光PCR检测是很容易出现污染的，操作的时候要非常谨慎。而且环境中如果存在污染是很难去除的。估计你的操作也是有问题的。你把阴性血清和高浓度的标准品一起准备，是很容易把阴性血清污染到的。
2、我以前提取核酸，把阳性样本和阴性样本一起提取，有时候阴性样本也会被污染，真的是防不胜防。
3、你们的实验台不用次氯酸纳溶液擦吗？我们实验室出现污染，除了照紫外，要把所有的台面用次氯酸钠擦一遍，然后关上门窗闷一晚上。而且每次实验开始前，我们的台面都要喷上75%的乙醇，擦一遍，再做实验。
4、如果阴性血清一直有抬头，也不排除阴性血清被污染的可能。
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yuer_
7楼2017-01-17 13:49:16
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许彦

木虫 (正式写手)
你是做的临床样本吗？扩增产物是否开盖过？方便透露下是什么厂家吗？

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8楼2017-01-17 16:38:26
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许彦

木虫 (正式写手)
可以做个空白对照，不加样本看看，有可能是试剂本身质量问题？

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9楼2017-01-17 16:39:23
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yuer_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 山舞银蛇 at 2017-01-16 18:07:08
多少个重复，确定纯水就没有污染？而不是概率事件？如果是，考虑下是不是提取污染。这个发生率很高。如果是提取发生污染，你换个厂家的试剂盒一样出，可以作为验证。
...

三孔重复 纯水做对照也做了三次试验了，都没有荧光 也不知道是不是纯水和阴性血清差太多
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10楼2017-01-18 09:29:21
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