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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 包涵体纯化重复性差
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mikkoma

新虫 (初入文坛)

[求助] 包涵体纯化重复性差 已有3人参与

求助:本人目的蛋白大小14kd，his tag，含二硫键，表达在包涵体里。现在已经做过几次纯化，先用超声破碎，在超声洗涤3次，再用6M盐酸胍溶解，再稀释复性，透析除去盐酸胍，透析时间3~4天，在上镍柱纯化。现在纯化最高做出来1mg/ml的，但是很不稳定，有几次高点，后来再做就做不出来高浓度的了。重复性很差。我每次都做SDS-PAGE，前期包涵体处理应该没有啥问题，每次都差不多，后面纯化的SDS-PAGE显示蛋白挂柱的情况不好，我估计是复性这个环节出了问题，我做包涵体复性做的少，不知道这中间哪个步骤出了问题，想请教坛子里的大神们，帮忙分析下原因，那个环节有问题会导致后面纯化的浓度低。谢谢啦
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1楼 2017-01-11 14:43:32
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
你复性时间3-4天  是不是时间太长了？一个白天加一晚上过夜不够吗？
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5楼2017-01-12 09:37:29
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普通回帖

415881168


发自小木虫IOS客户端
2楼2017-01-11 14:53:24
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mikkoma

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 415881168 at 2017-01-11 14:53:24

同道中人？
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3楼2017-01-11 15:00:29
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mikkoma

新虫 (初入文坛)
我的复性液中加了L-Arg，这个对后面的挂柱是不是有影响？
大神们help
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4楼2017-01-11 15:02:41
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
稀释复性，稀释多少倍，体积多少。透析3-4天，有什么依据吗，一般一天一夜换液3次足足够了
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
6楼2017-01-13 08:37:44
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mikkoma

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by XMC-7 at 2017-01-13 08:37:44
稀释复性，稀释多少倍，体积多少。透析3-4天，有什么依据吗，一般一天一夜换液3次足足够了

50,或者100ml包涵体溶液稀释到1L复性液中，10-20倍。透析短了怕透析的不透彻。L-ARG对后面的挂柱会不会有影响？这次重新调整了复性液，把精氨酸去掉了，加了gly，但是效果还是不好，复性过程中就出现絮状沉淀了，是不是复性失败了？
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7楼2017-01-13 14:02:58
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mikkoma

新虫 (初入文坛)
顶顶顶，不要沉
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8楼2017-01-13 14:08:41
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一定要用盐酸胍啊？试过尿素没？我是很不喜欢用盐酸胍的，即使用，也可以摸摸用低一点的浓度试试能不能溶解，不一定要用到那么高。
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9楼2017-01-13 14:28:50
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mikkoma

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-13 14:28:50
一定要用盐酸胍啊？试过尿素没？我是很不喜欢用盐酸胍的，即使用，也可以摸摸用低一点的浓度试试能不能溶解，不一定要用到那么高。

我基本上都用盐酸胍，溶解性好，尿素用过，后来还是换了盐酸胍
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10楼2017-01-13 16:34:11
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