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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 反转录后发现扩增的cDNA含内含子
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winehappyue

新虫 (初入文坛)

[交流] 反转录后发现扩增的cDNA含内含子 已有5人参与

求各位大神帮忙！！！

反转录PCR后，发现目的条带中含有一段100bp左右的内含子序列！
现怀疑是提RNA时DNA没有消化完全。

求问是否可以在得到的RNA中直接加入DNA消化酶，再反转？如果可以，有推荐的产品么，加入量是多少？
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1楼 2016-12-30 17:19:20
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君恋多

新虫 (小有名气)
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可以，但是消化完基因组DNA后，还要把rna再抽提一遍，去除里面的酶，盐离子等等。用dna酶I，具体用量看说明书就行了。

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2楼2016-12-30 22:38:06
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winehappyue

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 君恋多 at 2016-12-30 22:38:06
可以，但是消化完基因组DNA后，还要把rna再抽提一遍，去除里面的酶，盐离子等等。用dna酶I，具体用量看说明书就行了。

谢谢，明白了。我去做一下试试，不过，你说我酶的浓度提高一下行不？
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3楼2017-01-02 10:16:14
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君恋多

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by winehappyue at 2017-01-02 10:16:14
谢谢，明白了。我去做一下试试，不过，你说我酶的浓度提高一下行不？...

一般不用吧，里面应该也没有多少基因组。

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4楼2017-01-02 10:53:47
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君恋多

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by winehappyue at 2017-01-02 10:16:14
谢谢，明白了。我去做一下试试，不过，你说我酶的浓度提高一下行不？...

另外，消化完后，抽提的时候要在体系里面补几百微升的无rna酶的灭菌双蒸水。
还要注意保持低温，不要让rna降解了。

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5楼2017-01-02 10:57:50
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
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你好，有几个问题想要请教一下。我们最近想提取一个真核的基因，看看能不能在大肠杆菌里表达获得有活性的蛋白。做的时候大致步骤就是先提取真核生物的总RNA，之后用试剂盒里的通用引物进行发转录获得cDNA，在用cDNA为模板，目的基因上下游引物pcr的时候发现片段都在500bp以下（目的片段1500bp左右），请问这是怎么回事呢？
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···
6楼2017-02-21 19:03:40
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匿名

用户注销 (著名写手)
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7楼2017-02-21 22:11:51
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)
★
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首先，你做RT用的是什么，有的RT试剂盒里面直接包含DNase的，有的没有；没有的话就需要自行消解，一般用RQ1即可。你可以将自己的RNA先跑个电泳，上样量300ng即可，看看有没有明显的基因组条带。
自行用RQ1消解的话，可以先将你所有的样品都拿来消解，然后纯化，然后取1-2μg做RT；也可以直接取1-2μg做消解，然后把消解产物直接RT。
最后提醒一点，确定你的序列信息，包含内含子的具体情况是什么样的，是不是有可能发生的As事件，如果是，没准又可以出一篇文章。。
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8楼2017-02-22 09:43:35
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2220360280

银虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2017-02-22 09:43:35
首先，你做RT用的是什么，有的RT试剂盒里面直接包含DNase的，有的没有；没有的话就需要自行消解，一般用RQ1即可。你可以将自己的RNA先跑个电泳，上样量300ng即可，看看有没有明显的基因组条带。
自行用RQ1消解的话 ...

确定内含子的方法除了比对DNA与CDNA以外，还有什么其他的方法可以预测内含子数目，其他的一些结合位点的信息。
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天才是90%的努力加1%的灵感，最后坚持为9%，这为成功定律！
9楼2017-04-21 18:34:36
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