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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 反转录后发现扩增的cDNA含内含子
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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winehappyue

新虫 (初入文坛)

[交流] 反转录后发现扩增的cDNA含内含子 已有5人参与

求各位大神帮忙！！！

反转录PCR后，发现目的条带中含有一段100bp左右的内含子序列！
现怀疑是提RNA时DNA没有消化完全。

求问是否可以在得到的RNA中直接加入DNA消化酶，再反转？如果可以，有推荐的产品么，加入量是多少？
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1楼 2016-12-30 17:19:20
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，有几个问题想要请教一下。我们最近想提取一个真核的基因，看看能不能在大肠杆菌里表达获得有活性的蛋白。做的时候大致步骤就是先提取真核生物的总RNA，之后用试剂盒里的通用引物进行发转录获得cDNA，在用cDNA为模板，目的基因上下游引物pcr的时候发现片段都在500bp以下（目的片段1500bp左右），请问这是怎么回事呢？
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···
6楼2017-02-21 19:03:40
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君恋多

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以，但是消化完基因组DNA后，还要把rna再抽提一遍，去除里面的酶，盐离子等等。用dna酶I，具体用量看说明书就行了。

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2楼2016-12-30 22:38:06
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winehappyue

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 君恋多 at 2016-12-30 22:38:06
可以，但是消化完基因组DNA后，还要把rna再抽提一遍，去除里面的酶，盐离子等等。用dna酶I，具体用量看说明书就行了。

谢谢，明白了。我去做一下试试，不过，你说我酶的浓度提高一下行不？
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3楼2017-01-02 10:16:14
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君恋多

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by winehappyue at 2017-01-02 10:16:14
谢谢，明白了。我去做一下试试，不过，你说我酶的浓度提高一下行不？...

一般不用吧，里面应该也没有多少基因组。

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4楼2017-01-02 10:53:47
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