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研究生三年，感觉就会了PCR。。。。
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研究生三年，感觉就会了PCR，所以就想开个贴跟大家讨论一下。 Sample Text 遇到问题想找到原因并解决它，那么首先必须了解其作用原理。所以我们首先回顾一下PCR作用原理：利用DNA在体外高温时会变性成单链，低温时引物会与单链按照碱基互补配对的原则 结合，当调整温度至DNA聚合酶的最适反应温度时，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（即通常所说的5’~ 3’）的方向合成互补链。因此，在一个体系内提供DNA复制所需的原料（模板、引物、 DNA聚合酶、dNTP）和缓冲液（buffer），通过温度变化控制 DNA的变性和复性即可实现特定DNA片段的体外复制。 那么问题来了，为什么如此之简单的作用原理，实验结果却总是出现这样或那样的问题呢？ 1.花费了几个小时最后凝胶电泳检测却发现没有扩增出条带，这是为什么呢？ 在PCR反应的关键环节包括：模板制备、引物的质量与特异性、酶的质量、PCR循环条件，这些关键环节都有可能导致PCR扩增不出条带，下面是具体可能原因。 (1)模板问题： 模板中含有杂质蛋白； 模板中含有酶抑制剂； 模板中GC含量太高或太低； 提取制备模板时得率很低，或吸入酚等物质； 模板核酸变性不彻底或被降解。 酶和引物质量比较好，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理、模板核酸提取过程中出了问题，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 (2)引物问题： 引物质量、引物浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因，相应的对策如下： 遵循引物设计基本原则，在进行引物设计时需考虑引物长度、引物GC含量及碱基分布情况、尽量避开引物内部及引物间互补、两条引物退火温度接近等； 选定一个质量好的可信度高的引物合成单位； 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融导致引物变质降解失效。 (3)酶失活： 需要更换新酶或新旧两种酶同时使用，以分析是否是由于酶活性丧失或不够而导致扩增不出条带，还有可能是反应体系中忘加酶。 (4)Mg2+浓度问题： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过低影响酶的活性，从而使PCR扩增失败而扩增不出条带。 (5)其他原因： 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR扩增失败； 引变性温度低，变性时间短，退火温度过高或过低都会影响PCR扩增。 2.PCR扩增出现条带却不是我想要的（非特异性扩增），这又是为什么呢？ 引物特异性差或引物浓度过高，出现非特异性扩增； 酶质量不高或者酶浓度过高，更换酶或者降低酶量； 退火温度偏低，提高退火温度，减少非特异性扩增； 循环次数太多，减少循环次数，减少非特异性扩增； 模板浓度过高，适当降低模板浓度； 3.PCR扩增，前后有拖尾现象，产生原因以及如何避免呢？ 如果是RNA，可能抽提过程中有基因组DNA或蛋白质污染，需重新抽提； 如电泳缓冲液时间太长，PH值和盐离子浓度明显改变，需更换电泳缓冲液； 电泳时电压太高，调低电泳电压； 加样量过多，造成加样孔超载，导致拖尾和弥散； 制胶过程中胶孔没制好； EB没有冲洗干净； 制胶过厚，而点样量太少，点样时样粘附在孔壁上，导致拖尾。 在此告诉你们一个秘密，选择一款好的产品能让你省去不少实验中的麻烦，听说诺唯赞的phanta酶很好用哦，当然还有其他产品，不信你可以试试，包您满意！ 摘自诺唯赞微信公众号，感觉有帮助。 |
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21楼2017-01-04 14:54:04
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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你好，看楼主好专业呀，我想问如果我的引物能检测出来，样品检测也没有问题，但是在做实时定量的时候发现没有出现CT值，不知道怎么回事，希望楼主能够帮忙解决。 发自小木虫Android客户端 |
23楼2017-01-04 20:15:43
25楼2017-01-05 10:56:05
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