| 查看: 9044 | 回复: 44 | |||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
[交流]
研究生三年，感觉就会了PCR。。。。
|
|||||
|
研究生三年，感觉就会了PCR，所以就想开个贴跟大家讨论一下。 Sample Text 遇到问题想找到原因并解决它，那么首先必须了解其作用原理。所以我们首先回顾一下PCR作用原理：利用DNA在体外高温时会变性成单链，低温时引物会与单链按照碱基互补配对的原则 结合，当调整温度至DNA聚合酶的最适反应温度时，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（即通常所说的5’~ 3’）的方向合成互补链。因此，在一个体系内提供DNA复制所需的原料（模板、引物、 DNA聚合酶、dNTP）和缓冲液（buffer），通过温度变化控制 DNA的变性和复性即可实现特定DNA片段的体外复制。 那么问题来了，为什么如此之简单的作用原理，实验结果却总是出现这样或那样的问题呢？ 1.花费了几个小时最后凝胶电泳检测却发现没有扩增出条带，这是为什么呢？ 在PCR反应的关键环节包括：模板制备、引物的质量与特异性、酶的质量、PCR循环条件，这些关键环节都有可能导致PCR扩增不出条带，下面是具体可能原因。 (1)模板问题： 模板中含有杂质蛋白； 模板中含有酶抑制剂； 模板中GC含量太高或太低； 提取制备模板时得率很低，或吸入酚等物质； 模板核酸变性不彻底或被降解。 酶和引物质量比较好，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理、模板核酸提取过程中出了问题，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 (2)引物问题： 引物质量、引物浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因，相应的对策如下： 遵循引物设计基本原则，在进行引物设计时需考虑引物长度、引物GC含量及碱基分布情况、尽量避开引物内部及引物间互补、两条引物退火温度接近等； 选定一个质量好的可信度高的引物合成单位； 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融导致引物变质降解失效。 (3)酶失活： 需要更换新酶或新旧两种酶同时使用，以分析是否是由于酶活性丧失或不够而导致扩增不出条带，还有可能是反应体系中忘加酶。 (4)Mg2+浓度问题： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过低影响酶的活性，从而使PCR扩增失败而扩增不出条带。 (5)其他原因： 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR扩增失败； 引变性温度低，变性时间短，退火温度过高或过低都会影响PCR扩增。 2.PCR扩增出现条带却不是我想要的（非特异性扩增），这又是为什么呢？ 引物特异性差或引物浓度过高，出现非特异性扩增； 酶质量不高或者酶浓度过高，更换酶或者降低酶量； 退火温度偏低，提高退火温度，减少非特异性扩增； 循环次数太多，减少循环次数，减少非特异性扩增； 模板浓度过高，适当降低模板浓度； 3.PCR扩增，前后有拖尾现象，产生原因以及如何避免呢？ 如果是RNA，可能抽提过程中有基因组DNA或蛋白质污染，需重新抽提； 如电泳缓冲液时间太长，PH值和盐离子浓度明显改变，需更换电泳缓冲液； 电泳时电压太高，调低电泳电压； 加样量过多，造成加样孔超载，导致拖尾和弥散； 制胶过程中胶孔没制好； EB没有冲洗干净； 制胶过厚，而点样量太少，点样时样粘附在孔壁上，导致拖尾。 在此告诉你们一个秘密，选择一款好的产品能让你省去不少实验中的麻烦，听说诺唯赞的phanta酶很好用哦，当然还有其他产品，不信你可以试试，包您满意！ 摘自诺唯赞微信公众号，感觉有帮助。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白表达纯化鉴定精华 | 我的收藏 |
» 猜你喜欢
拉坦前列腺素(Latanoprost)：前列腺素F2α衍生物如何成为青光眼一线用药
已经有0人回复
-
卟啉家族中的明星分子：MESO-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉的性质与制备
已经有1人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有243人回复
-
宠物寄生虫防治：氟雷拉纳阻断GABA受体，持效12周驱杀跳蚤蜱虫
已经有0人回复
-
为呼吸打开通道：依伐卡托的科学之旅
已经有1人回复
-
Dordaviprone（ONC201）：小分子药物在中线胶质瘤中的应用
已经有0人回复
-
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
-
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展
已经有0人回复
-
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘
已经有1人回复
-
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展
已经有0人回复
-
PROTAC药物开发选择VHL配体：MDK-7526以87%出口向量占有率成首选
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 研究生三年，收获许多
已经有654人回复
- 还没开始去上研究生，就有一种厌恶的感觉
已经有12人回复
- 感觉研究生读的好失败，心情很低落
已经有53人回复
- 准研究生求指导，这个决定是否正确（非211不想读了）
已经有60人回复
- 跨专业人员咨询计算机专业研究生，人工神经网络，真心希望大家帮助
已经有24人回复
- 2011年总结，2012年展望
已经有35人回复
- 青基机会已失，准备对NSFC笔封几年，可能厚积薄发也可能离开学术，就再罗嗦两句吧
已经有44人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
【帮转急招】深大计算机/电子信息博士 王牌专业，大牛团队！
+5/865
-
征结婚对象，男找女，坐标【北京】【北京】【北京】
+5/250
-
复旦大学化学系董安钢-李同涛团队招聘博士后（3-5名）
+3/177
-
真诚才是必杀技
+1/95
-
山东第一医科大学泰山学者团队2026年招收副教授、博士后（不限专业）
+1/83
-
替投稿20天的论文祈福
+1/71
-
海南医科大学肖华教授(国家级青年人才)招收博士生1名---报名从速
+4/36
-
江西理工大学稀土学院急招博士生（2026年9月入学）2名，稀土光功能材料方向，非诚勿扰
+1/31
-
招聘青年教师（有编制）——南京邮电大学柔性电子全国重点实验室徐申课题组
+1/29
-
【博士招生】武汉科技大学招收材料、化工、环境、冶金类2026年“申请-考核”制博士生
+1/17
-
深圳大学物理与光电工程学院/深圳先进光源研究院招收2026级联合培养博士生
+1/13
-
上海理工大学-赵斌教授课题组招收申请考核制博士【新能源材料】
+1/11
-
海南大学生物医学工程学院 （光学诊疗团队）诚邀优秀人才
+1/9
-
合成
+1/8
-
张兆威教授课题组长期招聘科研助理
+1/6
-
紧急招收2026年秋季入学博士生1名（河北工大/北京科技大学联合 增材制造/生物材料）
+1/5
-
深圳理工大学核酸药物递送与干细胞工程课题组科研助理教授和博士后招聘启事
+1/4
-
北航国新院季梦奇副教授招聘博士(智能感知、立体视觉等)
+1/4
-
北航杭州国际校区招聘3D 打印，陶瓷，力学等方向博士后
+1/1
-
易度质量流量计在防水透气膜透气性测试中的应用
+1/1
24楼2017-01-05 10:22:57
19楼2017-01-04 10:47:26
7楼2016-12-30 09:49:56
9楼2016-12-31 22:21:13
13楼2017-01-02 00:27:12
15楼2017-01-03 15:11:40
16楼2017-01-03 23:50:10
17楼2017-01-04 09:39:54
20楼2017-01-04 12:58:10
21楼2017-01-04 14:54:04
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
你好，看楼主好专业呀，我想问如果我的引物能检测出来，样品检测也没有问题，但是在做实时定量的时候发现没有出现CT值，不知道怎么回事，希望楼主能够帮忙解决。 发自小木虫Android客户端 |
23楼2017-01-04 20:15:43
25楼2017-01-05 10:56:05
26楼2017-01-05 23:34:41
27楼2017-01-06 12:25:57
28楼2017-01-10 16:33:08
29楼2017-01-10 16:39:21
30楼2017-01-10 20:19:04
31楼2017-01-11 13:39:17
32楼2017-01-11 22:27:48
33楼2017-01-11 23:00:49
35楼2017-01-13 23:49:07
36楼2017-01-13 23:56:52
37楼2017-01-14 08:19:49
41楼2017-04-25 22:06:57
42楼2017-04-25 23:32:10
43楼2017-09-20 09:40:19
44楼2018-03-27 19:41:17
45楼2020-01-17 09:13:07
简单回复
zimu01042楼
2016-12-30 09:28
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
spc083楼
2016-12-30 09:32
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
2016-12-30 09:46
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
哈 发自小木虫IOS客户端
包子home5楼
2016-12-30 09:47
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
2016-12-30 09:48
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
象拔蚌丶8楼
2016-12-30 10:34
回复
谢谢分享 发自小木虫Android客户端
yulin068110楼
2016-12-31 23:50
回复
yanlijuan11楼
2017-01-01 00:04
回复
橙子不小12楼
2017-01-01 15:13
回复
呃嘟嘟14楼
2017-01-02 11:54
回复
mailmrcai18楼
2017-01-04 10:46
回复
专属cc22楼
2017-01-04 15:37
回复
y雨tak34楼
2017-01-13 23:33
回复
Lindsay-ZT38楼
2017-02-15 20:15
回复
车前子ing39楼
2017-03-02 17:19
回复
谢谢分享
gbc琛40楼
2017-04-25 13:29
回复
