| 查看: 9644 | 回复: 44 | |||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||||
[交流]
研究生三年，感觉就会了PCR。。。。
|
|||||
|
研究生三年，感觉就会了PCR，所以就想开个贴跟大家讨论一下。 Sample Text 遇到问题想找到原因并解决它，那么首先必须了解其作用原理。所以我们首先回顾一下PCR作用原理：利用DNA在体外高温时会变性成单链，低温时引物会与单链按照碱基互补配对的原则 结合，当调整温度至DNA聚合酶的最适反应温度时，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（即通常所说的5’~ 3’）的方向合成互补链。因此，在一个体系内提供DNA复制所需的原料（模板、引物、 DNA聚合酶、dNTP）和缓冲液（buffer），通过温度变化控制 DNA的变性和复性即可实现特定DNA片段的体外复制。 那么问题来了，为什么如此之简单的作用原理，实验结果却总是出现这样或那样的问题呢？ 1.花费了几个小时最后凝胶电泳检测却发现没有扩增出条带，这是为什么呢？ 在PCR反应的关键环节包括：模板制备、引物的质量与特异性、酶的质量、PCR循环条件，这些关键环节都有可能导致PCR扩增不出条带，下面是具体可能原因。 (1)模板问题： 模板中含有杂质蛋白； 模板中含有酶抑制剂； 模板中GC含量太高或太低； 提取制备模板时得率很低，或吸入酚等物质； 模板核酸变性不彻底或被降解。 酶和引物质量比较好，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理、模板核酸提取过程中出了问题，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 (2)引物问题： 引物质量、引物浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因，相应的对策如下： 遵循引物设计基本原则，在进行引物设计时需考虑引物长度、引物GC含量及碱基分布情况、尽量避开引物内部及引物间互补、两条引物退火温度接近等； 选定一个质量好的可信度高的引物合成单位； 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融导致引物变质降解失效。 (3)酶失活： 需要更换新酶或新旧两种酶同时使用，以分析是否是由于酶活性丧失或不够而导致扩增不出条带，还有可能是反应体系中忘加酶。 (4)Mg2+浓度问题： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过低影响酶的活性，从而使PCR扩增失败而扩增不出条带。 (5)其他原因： 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR扩增失败； 引变性温度低，变性时间短，退火温度过高或过低都会影响PCR扩增。 2.PCR扩增出现条带却不是我想要的（非特异性扩增），这又是为什么呢？ 引物特异性差或引物浓度过高，出现非特异性扩增； 酶质量不高或者酶浓度过高，更换酶或者降低酶量； 退火温度偏低，提高退火温度，减少非特异性扩增； 循环次数太多，减少循环次数，减少非特异性扩增； 模板浓度过高，适当降低模板浓度； 3.PCR扩增，前后有拖尾现象，产生原因以及如何避免呢？ 如果是RNA，可能抽提过程中有基因组DNA或蛋白质污染，需重新抽提； 如电泳缓冲液时间太长，PH值和盐离子浓度明显改变，需更换电泳缓冲液； 电泳时电压太高，调低电泳电压； 加样量过多，造成加样孔超载，导致拖尾和弥散； 制胶过程中胶孔没制好； EB没有冲洗干净； 制胶过厚，而点样量太少，点样时样粘附在孔壁上，导致拖尾。 在此告诉你们一个秘密，选择一款好的产品能让你省去不少实验中的麻烦，听说诺唯赞的phanta酶很好用哦，当然还有其他产品，不信你可以试试，包您满意！ 摘自诺唯赞微信公众号，感觉有帮助。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白表达纯化鉴定精华 | 我的收藏 |
» 猜你喜欢
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有82人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有17人回复
-
散金
已经有64人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 研究生三年，收获许多
已经有654人回复
- 还没开始去上研究生，就有一种厌恶的感觉
已经有12人回复
- 感觉研究生读的好失败，心情很低落
已经有53人回复
- 准研究生求指导，这个决定是否正确（非211不想读了）
已经有60人回复
- 跨专业人员咨询计算机专业研究生，人工神经网络，真心希望大家帮助
已经有24人回复
- 2011年总结，2012年展望
已经有35人回复
- 青基机会已失，准备对NSFC笔封几年，可能厚积薄发也可能离开学术，就再罗嗦两句吧
已经有44人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
告别流水线爽文！108万字完结仙侠《女娲石之灵石奇缘（仙界篇）》值得细品
+1/9020
-
基金祈福
+1/968
-
散金祈福
+3/783
-
每年这时候我都再仔细读一遍《范进中举》
+1/472
-
华西生物制药研究院招聘科研助理
+2/400
-
基金申请小调查！预祝申请必定中中中！！祈福！！！
+5/280
-
南方医科大学|生物材料与医学工程团队诚聘科研助理
+2/252
-
散金求好运
+1/190
-
五大联赛看好哪支球队
+5/190
-
哈尔滨工业大学（校本部）电子与信息工程学院2027级博士招生
+1/63
-
上海交通大学张航课题组招聘博士后（电化学能量存储与转换）
+1/43
-
面上基金祈福
+1/42
-
坐标南京
+1/41
-
强耀生物金秋开学季活动，2026年8月18日-10月31日，肽库筛选低至2W5
+3/37
-
中山大学化学工程与技术学院欧阳钢锋/吴鑫课题组博士生（2027年入学）/博士后招聘启事
+1/34
-
瑞典-博后-固态电池-粘结剂-锂离子电池方向
+1/27
-
上海交通大学化学化工学院倪伟焱课题组招收2027年申请考核制博士生（电催化+高分子）
+1/12
-
中科院大连化学物理研究所 招聘 催化剂研发方向 科研助理 2名
+1/5
-
祈祷老公中国基
+1/4
-
清华大学环境课题组招聘环境工作专业客座生研究生2-3名（应用导向）
+1/2
24楼2017-01-05 10:22:57
19楼2017-01-04 10:47:26
7楼2016-12-30 09:49:56
9楼2016-12-31 22:21:13
13楼2017-01-02 00:27:12
15楼2017-01-03 15:11:40
16楼2017-01-03 23:50:10
17楼2017-01-04 09:39:54
20楼2017-01-04 12:58:10
21楼2017-01-04 14:54:04
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
你好，看楼主好专业呀，我想问如果我的引物能检测出来，样品检测也没有问题，但是在做实时定量的时候发现没有出现CT值，不知道怎么回事，希望楼主能够帮忙解决。 发自小木虫Android客户端 |
23楼2017-01-04 20:15:43
25楼2017-01-05 10:56:05
26楼2017-01-05 23:34:41
27楼2017-01-06 12:25:57
28楼2017-01-10 16:33:08
29楼2017-01-10 16:39:21
30楼2017-01-10 20:19:04
31楼2017-01-11 13:39:17
32楼2017-01-11 22:27:48
33楼2017-01-11 23:00:49
35楼2017-01-13 23:49:07
36楼2017-01-13 23:56:52
37楼2017-01-14 08:19:49
41楼2017-04-25 22:06:57
42楼2017-04-25 23:32:10
43楼2017-09-20 09:40:19
44楼2018-03-27 19:41:17
45楼2020-01-17 09:13:07
简单回复
zimu01042楼
2016-12-30 09:28
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
spc083楼
2016-12-30 09:32
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
2016-12-30 09:46
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
哈 发自小木虫IOS客户端
包子home5楼
2016-12-30 09:47
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
2016-12-30 09:48
回复
Alice 2016(金币+1): 谢谢参与
象拔蚌丶8楼
2016-12-30 10:34
回复
谢谢分享 发自小木虫Android客户端
yulin068110楼
2016-12-31 23:50
回复
yanlijuan11楼
2017-01-01 00:04
回复
橙子不小12楼
2017-01-01 15:13
回复
呃嘟嘟14楼
2017-01-02 11:54
回复
mailmrcai18楼
2017-01-04 10:46
回复
专属cc22楼
2017-01-04 15:37
回复
y雨tak34楼
2017-01-13 23:33
回复
Lindsay-ZT38楼
2017-02-15 20:15
回复
车前子ing39楼
2017-03-02 17:19
回复
谢谢分享
gbc琛40楼
2017-04-25 13:29
回复
