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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

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[交流] 研究生三年，感觉就会了PCR。。。。

研究生三年，感觉就会了PCR，所以就想开个贴跟大家讨论一下。
Sample Text
遇到问题想找到原因并解决它，那么首先必须了解其作用原理。所以我们首先回顾一下PCR作用原理：利用DNA在体外高温时会变性成单链，低温时引物会与单链按照碱基互补配对的原则结合，当调整温度至DNA聚合酶的最适反应温度时，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（即通常所说的5’~ 3’）的方向合成互补链。因此，在一个体系内提供DNA复制所需的原料（模板、引物、 DNA聚合酶、dNTP）和缓冲液（buffer），通过温度变化控制 DNA的变性和复性即可实现特定DNA片段的体外复制。

那么问题来了，为什么如此之简单的作用原理，实验结果却总是出现这样或那样的问题呢？

1.花费了几个小时最后凝胶电泳检测却发现没有扩增出条带，这是为什么呢？
在PCR反应的关键环节包括：模板制备、引物的质量与特异性、酶的质量、PCR循环条件，这些关键环节都有可能导致PCR扩增不出条带，下面是具体可能原因。
(1)模板问题：
模板中含有杂质蛋白；
模板中含有酶抑制剂；
模板中GC含量太高或太低；
提取制备模板时得率很低，或吸入酚等物质；
模板核酸变性不彻底或被降解。
酶和引物质量比较好，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理、模板核酸提取过程中出了问题，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
(2)引物问题：
引物质量、引物浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因，相应的对策如下：
遵循引物设计基本原则，在进行引物设计时需考虑引物长度、引物GC含量及碱基分布情况、尽量避开引物内部及引物间互补、两条引物退火温度接近等；
选定一个质量好的可信度高的引物合成单位；
引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融导致引物变质降解失效。
(3)酶失活：
需要更换新酶或新旧两种酶同时使用，以分析是否是由于酶活性丧失或不够而导致扩增不出条带，还有可能是反应体系中忘加酶。
(4)Mg2+浓度问题：
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过低影响酶的活性，从而使PCR扩增失败而扩增不出条带。
(5)其他原因：
靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，导致PCR扩增失败；
引变性温度低，变性时间短，退火温度过高或过低都会影响PCR扩增。

2.PCR扩增出现条带却不是我想要的（非特异性扩增），这又是为什么呢？
引物特异性差或引物浓度过高，出现非特异性扩增；
酶质量不高或者酶浓度过高，更换酶或者降低酶量；
退火温度偏低，提高退火温度，减少非特异性扩增；
循环次数太多，减少循环次数，减少非特异性扩增；
模板浓度过高，适当降低模板浓度；

3.PCR扩增，前后有拖尾现象，产生原因以及如何避免呢？
如果是RNA，可能抽提过程中有基因组DNA或蛋白质污染，需重新抽提；
如电泳缓冲液时间太长，PH值和盐离子浓度明显改变，需更换电泳缓冲液；
电泳时电压太高，调低电泳电压；
加样量过多，造成加样孔超载，导致拖尾和弥散；
制胶过程中胶孔没制好；
EB没有冲洗干净；
制胶过厚，而点样量太少，点样时样粘附在孔壁上，导致拖尾。
在此告诉你们一个秘密，选择一款好的产品能让你省去不少实验中的麻烦，听说诺唯赞的phanta酶很好用哦，当然还有其他产品，不信你可以试试，包您满意！
摘自诺唯赞微信公众号，感觉有帮助。

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